蛋白質(zhì)與酶工程知識(shí)點(diǎn)(完)---僅供參考

1、1、易錯(cuò)PCR:通過(guò)調(diào)整反應(yīng)條件來(lái)使PCR擴(kuò)增過(guò)程中復(fù)制錯(cuò)配率增加，在目的基因中隨機(jī)引入突變，繼而獲得蛋白質(zhì)分子的隨機(jī)突變體 * 提高鎂離子濃度或加入錳離子 * 降低體系中一種的dNTP濃度（至少5-10%） * 運(yùn)用低保真度DNA聚合酶 * 增加DNA聚合酶的濃度 屬于無(wú)性進(jìn)化：?jiǎn)我换騼?nèi)進(jìn)行遺傳突變，費(fèi)力、耗時(shí)，多用于小片段（800bp以下）2、 酶的概念：酶是一類(lèi)由活細(xì)胞產(chǎn)生的，對(duì)其特異底物（substrate）具有高效催化作用的生大分子，包括蛋白質(zhì)和核酸3、 輔酶 :與酶蛋白結(jié)合疏松，可用透析或超濾的方法除去(NAD+)。 輔基 :與酶蛋白結(jié)合緊密，不能用透析或超濾的方法除去(FAD、

2、FMN) 酶的活性中心 ：或稱(chēng)活性部位，指必需基團(tuán)在空間結(jié)構(gòu)上彼此靠近，組成具有特定空間結(jié)構(gòu)的區(qū)域，能與底物特異結(jié)合并將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。 4、抗體酶或催化抗體 ：是具有催化功能的抗體。本質(zhì)：免疫球蛋白，即具有催化作用的免疫球蛋白5、酶促反應(yīng)特點(diǎn)：1 酶促反應(yīng)具有極高的效率 2 酶促反應(yīng)具有高度的特異性：絕對(duì)特異性、相對(duì)特異性、立體結(jié)構(gòu)特異性3 酶促反應(yīng)的可調(diào)節(jié)性：對(duì)酶量的調(diào)節(jié)，對(duì)酶活性的調(diào)節(jié)6、 誘導(dǎo)契合假說(shuō)：酶與底物相互接近時(shí)，其結(jié)構(gòu)相互誘導(dǎo)、相互變形和相互適應(yīng)，進(jìn)而相互結(jié)合。這一過(guò)程稱(chēng)為酶-底物結(jié)合的誘導(dǎo)契合假說(shuō) 。7、 底物濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響：1 當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)：反應(yīng)速度與底物濃度成

3、正比；反應(yīng)為一級(jí)反應(yīng)。2 隨著底物濃度的增加：反應(yīng)速度不再成正比例加速；反應(yīng)為混合級(jí)反應(yīng)。3 當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_(dá)一定程度：反應(yīng)速度不再增加，達(dá)最大速度；反應(yīng)為零級(jí)反應(yīng)8、 Km與Vmax的意義9、 不可逆性抑制作用：抑制劑通常以共價(jià)鍵與酶活性中心或活性中心以外的必需基團(tuán)相結(jié)合，使酶失活。 可逆性抑制作用：抑制劑通常以非共價(jià)鍵與酶或酶-底物復(fù)合物可逆性結(jié)合，使酶的活性降低或喪失；抑制劑可用透析、超濾等方法除去。類(lèi)型：競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制、反競(jìng)爭(zhēng)性抑制。三種抑制劑的特點(diǎn)10、 酶的調(diào)節(jié)：v 酶活性的調(diào)節(jié)（快速調(diào)節(jié)）1 酶原與酶原的激活2 變構(gòu)（別構(gòu)）酶3 酶的共價(jià)修飾調(diào)節(jié)v 酶含量的調(diào)節(jié)（緩慢調(diào)節(jié)

4、）1 酶蛋白合成的誘導(dǎo)和阻遏2 酶降解的調(diào)控11、 酶原激活的意義 避免細(xì)胞產(chǎn)生的酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行自身消化，并使酶在特定的部位和環(huán)境中發(fā)揮作用，保證體內(nèi)代謝正常進(jìn)行。（消化管內(nèi)的蛋白酶）有的酶原可以視為酶的儲(chǔ)存形式。在需要時(shí)，酶原適時(shí)地轉(zhuǎn)變成有活性的酶，發(fā)揮其催化作用。（凝血酶與纖溶酶類(lèi)）12、 變構(gòu)調(diào)節(jié)一些代謝物可與某些酶分子活性中心外的某部分可逆地結(jié)合，使酶構(gòu)象改變，從而改變酶的催化活性，此種調(diào)節(jié)方式稱(chēng)變構(gòu)調(diào)節(jié)13、 兩種操縱子：乳糖操縱子、色氨酸操縱子14：細(xì)胞破碎法：v 實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模1 旋刀勻漿法2 研磨法3 高速珠磨法4 反復(fù)凍融5 滲透壓破碎法6 超聲勻漿法v 大規(guī)模提?。焊邏簞驖{法1

5、5、 解吸方法-洗脫原理 加大反離子的濃度，常用的反離子是NaCl 改變?nèi)芤旱膒H（改變結(jié)合基團(tuán)的電荷） 同時(shí)改變pH與離子強(qiáng)度交換劑選擇的一般原則： *酶蛋白穩(wěn)定存在的pH<pI，用陽(yáng)離子交換劑 *酶蛋白穩(wěn)定存在的pH>pI，用陰離子交換劑 *兩種pH條件下均能穩(wěn)定存在，二種交換劑均可 4、蛋白質(zhì)與酶的結(jié)構(gòu)和功能 16、 氨基酸的分類(lèi)：17、 拉氏構(gòu)象圖：兩相鄰肽鍵平面可相對(duì)旋轉(zhuǎn)（構(gòu)象角,）：圍繞C旋轉(zhuǎn)的構(gòu)象與角度18、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)：多肽鏈中氨基酸的排列順序。主要化學(xué)鍵：肽鍵（+二硫鍵）19、 螺旋(-helix)：多肽鏈的主鏈原子沿一中心軸盤(pán)繞所形成的有規(guī)律的右手螺旋構(gòu)象。簡(jiǎn)

6、言之，各個(gè)肽平面圍繞同一軸旋轉(zhuǎn)形成的右手螺旋構(gòu)象。兩親性螺旋：（重要）氨基酸側(cè)鏈從螺旋骨架伸出，形成螺旋表面一側(cè)親水（帶電、極性），一側(cè)疏水（易形成疏水內(nèi)核或疏水表面聚合）的特性。螺旋轉(zhuǎn)輪：螺旋沿著螺旋軸的二維投射圖，可以判斷alpa螺旋是否具有兩親性。影響-螺旋穩(wěn)定因素： 側(cè)鏈基團(tuán)空間位阻：如Ile、Trp、Phe側(cè)鏈基團(tuán)； 連續(xù)氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)帶有相同電荷（同種電荷互斥） Pro等亞氨基酸存在（不能形成氫鍵,且C參與吡咯環(huán)形成，環(huán)內(nèi)C-N和C-N鍵不能旋轉(zhuǎn)）。20、 motif 的層次、線性motif 的概念（重要）21、四級(jí)結(jié)構(gòu)：兩條和兩條以上多肽寡聚蛋白或多聚蛋白質(zhì)形成的高級(jí)結(jié)構(gòu)。亞基種

7、類(lèi)、數(shù)目、空間排布以及亞基互作是四級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定因素。 5、 蛋白質(zhì)與酶的修飾技術(shù)1、 酶分子修飾的概念和意義：概念：通過(guò)各種方法改變蛋白/酶的分子結(jié)構(gòu)，從而改變其某些特性和功能。主要途徑有化學(xué)途徑和分子生物學(xué)途徑。意義：1 提高蛋白/酶的活力,滿足/適應(yīng)生產(chǎn)工藝的要求2 增強(qiáng)蛋白/酶的穩(wěn)定性3 提高、降低或消除蛋白/酶的抗原性4 研究和了解蛋白/酶的結(jié)構(gòu)：5 彌補(bǔ)天然蛋白的不足，賦予優(yōu)良性狀2、化學(xué)修飾的手段與方法：經(jīng)常被修飾的殘基：親核：絲、半胱、甲硫、蘇、賴(lài)、組 親點(diǎn)：酪、色3、側(cè)鏈基團(tuán)的修飾（1）羧基修飾反應(yīng)-水溶性碳二亞胺類(lèi)（最標(biāo)準(zhǔn)）、硼氟化三甲烊鹽（2）氨基修飾：采用某些化合物使酶分子

8、側(cè)鏈氨基發(fā)生改變，從而改變酶蛋白的空間構(gòu)象的方法稱(chēng)為氨基修飾1 亞硝酸 2 2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）、34（3）巰基修飾：巰基在許多酶中是活性中心的催化基團(tuán)，巰基還可與另一巰基形成二硫鍵，因此對(duì)穩(wěn)定酶的結(jié)構(gòu)和發(fā)揮催化功能具有重要的作用。常用修飾劑：烷基化試劑（碘乙酸、碘乙酰胺）、馬來(lái)酰亞胺（4）咪唑基修飾：組氨酸(咪唑基)位于許多酶的活性性中心。常用咪唑基修飾劑：焦碳酸二乙酯（DPC）和碘代乙酸（5）酚羥基（酪氨酸）修飾反應(yīng)：Tyr（酪氨酸）殘基修飾主要是酚羥基的修飾，Thr和Ser殘基修飾為羥基修飾，但反應(yīng)條件苛刻（6）胍基(精氨酸）化學(xué)修飾反應(yīng)：采用二羰基化合物與胍基反應(yīng)生成穩(wěn)

9、定的雜環(huán)，從而改變酶分子空間構(gòu)象的方法。修飾劑：丁二酮、1，2-環(huán)己二酮、丙二醛和苯乙二醛（二羰基化合物）（7）吲哚基(色氨酸)化學(xué)修飾反應(yīng)：4、 大分子結(jié)合（共價(jià)）修飾：修試劑：聚乙二醇（PEG）、單甲氧基聚乙二醇（MPEG）、右旋糖酐5、分子內(nèi)交聯(lián)修飾：雙功能基團(tuán)化合物（雙功能試劑）：戊二醛、己二胺、葡聚糖二乙醛等，在酶蛋白分子中相距較近的兩個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)之間形成共價(jià)交聯(lián)，從而提高酶穩(wěn)定性的修飾方法。6、金屬離子置換修飾：把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的修飾方法。作用如下：1 闡明金屬離子對(duì)酶催化作用的影響2 提高酶活力3 增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性4 改變酶的動(dòng)力學(xué)特性

10、7、 氨基酸化學(xué)置換修飾：將酶分子肽鏈上的某一個(gè)氨基酸換成另一個(gè)氨基酸的修飾方法。缺點(diǎn)：難度大，成本高，專(zhuān)一性差，而且對(duì)酶分子逐個(gè)進(jìn)行修飾，操作復(fù)雜，難以工業(yè)化生產(chǎn)。8、 蛋白質(zhì)片段嵌合修飾：一個(gè)天然多肽與一個(gè)人造多肽（或化學(xué)修飾）相締合，產(chǎn)生半合成結(jié)構(gòu)9、 分子生物學(xué)方法：定點(diǎn)突變技術(shù) 10:、細(xì)胞內(nèi)修飾： 6、蛋白質(zhì)與酶分子設(shè)計(jì)1、 蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的分類(lèi)1 “小改”：定位突變和化學(xué)修飾2 “中改”：結(jié)構(gòu)域進(jìn)行拼接組裝3 “大改”：完全從頭設(shè)計(jì)全新的蛋白質(zhì)2、蛋白質(zhì)與酶分子設(shè)計(jì)原理（重要）1 內(nèi)核假設(shè)：蛋白質(zhì)在進(jìn)化中，由氫鍵連接的二級(jí)結(jié)構(gòu)保守內(nèi)部單元組成區(qū)域（骨架）。2 內(nèi)部密堆積，無(wú)重疊。

11、3 內(nèi)部氫鍵是最大限度滿足的(主鏈及側(cè)鏈)。4 最優(yōu)的氨基酸側(cè)鏈幾何排列5 疏水基團(tuán)與親水基團(tuán)需合理分布：需安排少量的疏水基團(tuán)在表面，少量的親水基團(tuán)在內(nèi)部。6 金屬蛋白配位殘基的替換應(yīng)滿足金屬配位幾何，且金屬中心與外圍第二殼層相互作用十分重要7 結(jié)構(gòu)和功能具有專(zhuān)一性（蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)最困難問(wèn)題3、 先導(dǎo)化合物：即原型物，是通過(guò)各種途徑或方法得到的具有一定生物活性的化學(xué)物質(zhì)，有可能進(jìn)一步優(yōu)化（活性不高、特異性差、毒副作用大、或藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)差）而得到供臨床使用的藥物。4、不同氨基酸的特征：估計(jì)就選擇：5、從頭設(shè)計(jì)法：是指基于對(duì)蛋白質(zhì)折疊規(guī)律的認(rèn)識(shí)，從氨基酸的序列出發(fā)，設(shè)計(jì)制造自然界中不存在的全新蛋白質(zhì)

12、，使之具有特定的空間結(jié)構(gòu)和預(yù)期的功能。8、 固定化酶與固定化細(xì)胞1、 酶固定化：采用各種方法，將酶與水不溶性載體結(jié)合，制備固定化酶的過(guò)程成為酶的固定化。方法：吸附法、包埋法、結(jié)合法、交聯(lián)法.2、 四種方法的比較1) 吸附法： 利用各種固體吸附劑將酶或含酶細(xì)胞吸附在其表面上而使酶固定的方法，又稱(chēng)為物理吸附法常用吸附劑：活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、條件溫和、不易變性失活、載體廉價(jià)、可反復(fù)使用。缺點(diǎn)：酶與載體結(jié)合不牢固，易脫落2) 包埋法：將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法。根據(jù)包埋的材料和包埋方法的不同，可分為：凝膠包埋法和半透膜包埋法（微囊化法） 凝膠包埋法

13、：半透膜包埋法：適用于底物和產(chǎn)物都是小分子的酶的固定化。半透膜：聚酰胺膜、火棉 膠膜等3) 結(jié)合法：分為離子鍵結(jié)合法和共價(jià)鍵結(jié)合法離子鍵結(jié)合法：通過(guò)離子鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法。載體：DEAE-纖維素、TEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠、CM-纖維素。優(yōu)點(diǎn)：條件溫和、操作簡(jiǎn)便、活力損失少。缺點(diǎn)：酶與載體結(jié)合不牢固，使用時(shí)需嚴(yán)格控制好pH值、離子強(qiáng)度、溫度等操作條件。共價(jià)鍵結(jié)合法：通過(guò)共價(jià)鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法。載體：纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼質(zhì)、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等。方法：重氮法、疊氮法、溴化氰發(fā)、烷基化法4) 交聯(lián)法：利用雙功能試劑，在酶分子間或酶與載體間

14、，或酶與惰性蛋白間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，以制備固定化酶的方法。交聯(lián)試劑：戊二醛（常用）、己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶氮苯等。 優(yōu)點(diǎn)：結(jié)合牢固，酶不會(huì)脫落，可長(zhǎng)時(shí)間使用。 缺點(diǎn)：交聯(lián)反應(yīng)條件激烈，酶的多個(gè)基團(tuán)被交聯(lián)，致使酶的活力損失大。制備的固定化酶顆粒較小，不便于使用。2、細(xì)胞的固定化：固定在載體上并在一定空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)的細(xì)胞。常用凝膠包埋法優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：3、固定化酶優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：9、 酶的非水相催化1、 非水介質(zhì)酶催化反應(yīng)優(yōu)點(diǎn)：2、酶的非水相催化類(lèi)型：1) 有機(jī)介質(zhì)中的酶催化：酶在含有一定量水（結(jié)合水和溶劑水）的有機(jī)溶劑中進(jìn)行的催化反應(yīng)。反應(yīng)體系：A.微水介質(zhì)體系、B.與水溶性有機(jī)溶劑組成的均一體

15、系、C.與水不溶性有機(jī)溶劑組成的兩相或多相體系、D.正膠束體系（水包油）、E.反膠束體系（油包水） 適用于：疏水性物質(zhì)（底物或產(chǎn)物）的酶催化作用反應(yīng)體系：兩相界面進(jìn)行最適水含量：催化反應(yīng)速度達(dá)到最大時(shí)的水含量 水活度：描述有機(jī)溶劑中酶活性與水含量關(guān)系，即為一定壓力和溫度下，反應(yīng)體系中的水摩爾分?jǐn)?shù)與水活度系數(shù)的乘積。它看直接反映體系中的水分情況，與反應(yīng)體系中的水含量和有機(jī)溶劑的極性無(wú)關(guān)。不同的酶有不同的最佳水活度。 極性系數(shù)lgP：反應(yīng)有機(jī)溶劑與酶活力之間的關(guān)系（P為溶劑在正辛醇和水中的分配系數(shù)）。lgP越大，表明其極性越小，疏水性越強(qiáng)。v 極性較強(qiáng)有機(jī)溶劑，會(huì)奪取酶分子的結(jié)合水，影響酶分子微環(huán)境水化層，降低酶催化活性，甚至導(dǎo)致酶變性失活。一般選用2lgP4的有機(jī)溶劑作為有機(jī)介質(zhì)為宜2) 氣相介質(zhì)中的酶催化：適于底物為氣體或者能夠轉(zhuǎn)化為氣體物質(zhì)的酶催化反應(yīng)。3) 超臨界流體介質(zhì)中的酶催化：v 超臨界流體：溫度和壓力超過(guò)某物質(zhì)超臨界點(diǎn)的流體。常見(jiàn)的有：CO2、水、氨、甲醇、乙醇、乙烯。v 超臨界流體具備的條件：4) 離子液介質(zhì)中的酶催化：v 離子液：在室溫條件下，有機(jī)/無(wú)機(jī)陰-陽(yáng)離子低熔點(diǎn)鹽液，呈