H3-SOP-72503 降解實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程01（周雪飛+金美春+李偉舉）

1、標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程Standard Operating Procedure編號No.H3-SOP-72503版本號Version01 強(qiáng)降解實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程Standard Operating Procedure for Stress Testing頁碼Page9 of 9 強(qiáng)降解實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程Standard Operating Procedure for Stress Testing部門：Department簽字/日期：Signature/Date起草人：Prepared by QC分析技術(shù)支持部 審核人：Reviewed by API QC 審核人：Reviewed by API QA 批準(zhǔn)

2、人：Approved by 質(zhì)量負(fù)責(zé)人 頒發(fā)部門Issued by質(zhì)量法規(guī)部執(zhí)行日期Effective Date替換文件Replaced forH3-SOP-72503 00版復(fù)審日期Review Date分發(fā)部門Distributed toAPI QA、質(zhì)量法規(guī)部、分析中心、API QC1 目的 用藥品藥典的方法或者其他經(jīng)驗(yàn)證的含量及雜質(zhì)檢驗(yàn)方法來測定經(jīng)過各種條件強(qiáng)降解后的藥物，判斷此方法是否適用于降解雜質(zhì)的檢測，是否具有穩(wěn)定性指示性；同時探索藥物內(nèi)在的穩(wěn)定性特性如降解途徑，降解機(jī)制；鑒別和制備降解產(chǎn)物；探索藥品在儲藏過程中可能遇到的劇烈條件下的降解趨勢；還可以為樣品的包裝及儲存條件的選擇提

3、供依據(jù)。2 適用范圍 適用于中研院分析中心和API QC原料藥分析方法的降解研究。3 定義和術(shù)語 3.1 強(qiáng)降解試驗(yàn)（stress testing, or forced degradation study），也稱為破壞性試驗(yàn)，它是在人為設(shè)定的特殊條件下，如酸、堿、氧化、高溫、光照等，引起藥物的降解，通過對降解后樣品的測定，驗(yàn)證檢測方法的可行性，分析藥物可能的降解途徑和降解機(jī)制。試驗(yàn)需選取有代表性的一批樣品，可以是大生產(chǎn)的樣品，也可以是工藝路線與大生產(chǎn)相近的小試或中試的樣品。強(qiáng)降解實(shí)驗(yàn)需要做的項(xiàng)目包括光照、高溫、酸、堿、氧化、高濕等，可根據(jù)樣品的物理性質(zhì)選擇所需的強(qiáng)降解實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。強(qiáng)降解試驗(yàn)為方法

4、驗(yàn)證中專屬性試驗(yàn)的指標(biāo)之一，不是正式穩(wěn)定性研究的一部分。用既定方法對原樣及各種條件降解后的樣品進(jìn)行對比分析，并對主峰的峰純度使用二極管陣列（DAD或PDA）檢測器進(jìn)行純度分析，判斷該方法是否具有專屬性。如果主峰目視無干擾，峰純度符合標(biāo)準(zhǔn)，則認(rèn)為該方法具有穩(wěn)定性指示性。如果在較強(qiáng)的條件下樣品沒有明顯的降解，可認(rèn)為本品在該條件下比較穩(wěn)定。如果降解試驗(yàn)的結(jié)果顯示光破壞不穩(wěn)定，則產(chǎn)品的包裝應(yīng)考慮避光，在進(jìn)行產(chǎn)品的生產(chǎn)和樣品的處理過程中同樣應(yīng)考慮避光；通過高濕實(shí)驗(yàn)可以考察產(chǎn)品在高濕條件下的穩(wěn)定性，為產(chǎn)品貯存條件的選擇及制劑工藝研究提供依據(jù)；高溫實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可反映產(chǎn)品的耐熱情況，為產(chǎn)品的后期滅菌處理、貯存條

5、件的選擇或有可能經(jīng)歷的高溫情況下，可能引入的雜質(zhì)情況提供依據(jù)；通過酸堿氧化破壞的結(jié)果，可以反應(yīng)產(chǎn)品在酸性、堿性和氧化條件下的穩(wěn)定性，為產(chǎn)品研發(fā)階段工藝過程的控制，包裝和貯存條件的選擇，制劑的處方篩選和穩(wěn)定性研究提供依據(jù)。3.2 影響因素試驗(yàn)：此項(xiàng)試驗(yàn)是在比加速試驗(yàn)更激烈的條件下進(jìn)行，其目的是探討藥物的固有穩(wěn)定性、了解影響其穩(wěn)定性的因素及可能的降解途徑與降解產(chǎn)物，為制劑生產(chǎn)工藝、包裝、貯存條件和建立降解產(chǎn)物分析方法提供科學(xué)依據(jù)。供試品選用一批原料藥進(jìn)行，將供試品置適宜的開口容器中（如稱量瓶或培養(yǎng)皿），攤成5mm厚的薄層，疏松原料藥攤成10mm厚的薄層，進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)降解產(chǎn)物有明顯的變化

6、，應(yīng)考慮其潛在的危害性，必要時應(yīng)對降解產(chǎn)物進(jìn)行定性或定量分析。3.3 質(zhì)量守恒(Mass Balance)：質(zhì)量守恒是指所測得的藥品含量的下降與降解產(chǎn)物的增加之間的平衡關(guān)系。一般采用含量加總雜質(zhì)的方式，觀察其與100%接近的程度。質(zhì)量守恒在很多情況下無法得到，比如降解產(chǎn)生了一些無紫外吸收的物質(zhì)，使用HPLC-UV 方法無法測定?？梢酝ㄟ^質(zhì)量守恒的計(jì)算，來判斷方法是否具有穩(wěn)定指示性，是否可以測定所有的降解產(chǎn)物。4 責(zé)任中研院分析中心和API QC分析人員應(yīng)按照此規(guī)程進(jìn)行分析方法驗(yàn)證中的強(qiáng)降解研究。5 EHS要求使用酸、堿、氧化試劑及在做高溫實(shí)驗(yàn)時，須佩帶專用防護(hù)手套。推薦分析員在使用本實(shí)驗(yàn)用到的

7、試劑時先閱讀MSDS 和危害說明。6 程序6.1 分析方法驗(yàn)證或藥典方法確認(rèn)以及藥品重大工藝變更后（比如工藝路線變更，結(jié)晶方法變更）會導(dǎo)致藥品物理化學(xué)性質(zhì)和/或雜質(zhì)等發(fā)生顯著改變的，均需要進(jìn)行強(qiáng)降解研究。6.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容6.2.1 原樣檢驗(yàn) 用含量及雜質(zhì)的檢測方法檢測未破壞的樣品，作為控制樣品的對照。降解樣品及原樣檢測前需滿足系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)的要求。6.2.2 強(qiáng)降解試驗(yàn)6.2.2.1 光照ü 光源的選擇：一般選用有可見光和紫外輸出的人造日光燈，熒光燈，金屬鹵化物燈或氘燈的恒溫光照箱；或者讓樣品同時暴露在日光燈和近紫外熒光燈下(光譜范圍為320nm400nm，在350370nm有最大發(fā)

8、射能量；在320360nm及360400nm譜帶范圍內(nèi)紫外光應(yīng)具有顯著比例)。ü 光照方法：以恒溫光照箱為例取一定數(shù)量的樣品，平攤放入平皿中或者透明玻璃瓶中，必要時用透明的蓋子保護(hù)，樣品厚度不得超過3mm，置于恒溫光照箱內(nèi)，以600W/m2強(qiáng)度的紫外光下進(jìn)行光照數(shù)小時(需要根據(jù)光強(qiáng)度來確定具體需要的時間，但要保證總照度不低于120萬Lux.hr或近紫外能量不低于200W.hr/m2)，降解完成后，取樣，測定含量及雜質(zhì)結(jié)果，如果樣品破壞達(dá)到5%20%或在600W/m2強(qiáng)度的紫外光下進(jìn)行光照24小時后仍未被破壞，則可終止實(shí)驗(yàn)。還需要在相同環(huán)境下做一避光對照來排除其他因素如溫度的影響，避光

9、實(shí)驗(yàn)（Dark Control）的方法是另取一份樣品，同上述方法包裝，外面套用鋁箔袋遮光，同上述樣品相同條件下并排放置，降解完成后，取樣，測定結(jié)果與光照樣的結(jié)果比較。相比避光樣，光照樣中新增的雜質(zhì)或者升高的雜質(zhì)，通常被認(rèn)為是光降解產(chǎn)物。6.2.2.2 高溫取樣品適量，平攤放入平皿中或者稱量瓶中，樣品厚度不超過3mm，置于一定溫度(高溫試驗(yàn)通常選用溫度高于加速試驗(yàn)溫度的10，如50、60)，對于預(yù)知熱穩(wěn)定性比較強(qiáng)的藥物，放置在105 烘箱中，根據(jù)不同產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性破壞一定時間，取樣，測定含量及雜質(zhì)結(jié)果，如樣品破壞達(dá)到5%20%或樣品在105加熱48小時仍未被破壞，則可終止實(shí)驗(yàn)。為了明確樣品的穩(wěn)定

10、性，在105加熱24小時時，可選點(diǎn)取樣。6.2.2.3 酸解取待測量的樣品，置于規(guī)定體積的容量瓶中，先加入容量瓶約10%體積的溶劑溶解樣品，再加入一定量的1N的鹽酸溶液，通常為1ml，但若溶劑為堿性或樣品呈堿性，則加大鹽酸溶液的量，克服其堿性，使酸降解溶液落在低pH范圍。使溶解并混勻若不溶解，可先加少量稀釋劑使樣品溶解或成懸浮液后，混搖均勻，放置數(shù)小時，加入適量的稀釋劑，用1N的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至中性，再加稀釋劑稀釋至刻度。同時做空白溶液校正（除不加樣品外，其它步驟與降解處理過程相同，配制成空白溶液進(jìn)樣）。測定含量及雜質(zhì)結(jié)果。如果樣品破壞約5%20%或此條件下放置24小時后仍未被破壞，則可

11、終止實(shí)驗(yàn)，如果此條件下樣品被完全破壞或程序非常劇烈，可以選用更低濃度的鹽酸溶液(如0.1N) 或減少放置的時間等措施來進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)。6.2.2.4 堿解取待測量的樣品，置于規(guī)定體積的容量瓶中，先加入容量瓶約10%體積的溶劑溶解樣品，再加入一定量的1N的氫氧化鈉溶液，通常為1ml，但若溶劑為酸性或樣品呈酸性，則加大氫氧化鈉溶液的量，克服其酸性，使堿降解溶液落在高pH范圍。使溶解并混勻，若不溶解，可先加少量稀釋劑使樣品溶解或成懸浮液后，混搖均勻，室溫條件下放置數(shù)小時，加入適量的稀釋劑，用1N的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至中性，再加稀釋劑稀釋至刻度。同時做空白溶液校正（除不加樣品外，其它步驟與降解處理過程相同，

12、配制成空白溶液進(jìn)樣）。測定含量及雜質(zhì)結(jié)果，如果用樣品破壞約5%20%或此條件下放置24小時后仍未被破壞，則可終止實(shí)驗(yàn)，如果此條件下樣品被完全破壞或程序非常劇烈，可以選用更低濃度的氫氧化鈉溶液(如0.1N)或減少放置的時間等措施來進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)。若對于本身含酸的品種，做堿性破壞，應(yīng)該加入更多的堿，確保在樣品在堿性條件下放置破壞。6.2.2.5 氧化降解取待測量的樣品，置于規(guī)定體積的容量瓶中，先加入容量瓶約10%體積的溶劑溶解樣品，再加入1.0ml的30%的雙氧水溶液，使溶解并混勻（若不溶解，可先加少量稀釋劑使樣品溶解或成懸浮液后，混搖均勻），放置數(shù)小時，再加稀釋劑稀釋至刻度。同時做空白溶液校正（除不

13、加樣品外，其它步驟與降解處理過程相同，配制成空白溶液進(jìn)樣）。測定含量及雜質(zhì)結(jié)果，如果樣品破壞達(dá)5%20%或此條件下放置24小時后仍未被破壞，則可終止實(shí)驗(yàn)，如果此條件下樣品被完全破壞或程序非常劇烈，可以選用更低濃度的雙氧水溶液（如3%）或減少放置的時間等措施來進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)。6.2.2.6 高溫高濕取樣品適量，平攤放入平皿中或者稱量瓶中，樣品厚度不超過3mm，開口置恒濕密閉容器中，在40±2，75%±5%或更大（可放在恒溫恒濕箱中），條件下放置5天、10天，取樣，觀察樣品外觀，如果樣品變色或吸濕嚴(yán)重，可考慮縮短放置時間或是降低放置條件。同時測定含量及雜質(zhì)結(jié)果，如果此條件下樣品破壞

14、達(dá)5%20%或仍未被破壞，則可終止實(shí)驗(yàn)。6.2.3 影響因素試驗(yàn) （國內(nèi)注冊的藥物，根據(jù)注冊需要進(jìn)行影響因素試驗(yàn)）6.2.3.1 高溫試驗(yàn) 供試品開口置潔凈容器中，60溫度下放置10天，于第5天和第10天取樣，按穩(wěn) 定性重點(diǎn)考察項(xiàng)目進(jìn)行檢測。若供試品含量低于規(guī)定限度則在40條件下同法進(jìn)行試驗(yàn)。若60無明顯變化，不再進(jìn)行40試驗(yàn)。6.2.3.2 高濕試驗(yàn) 供試品開口置恒濕的潔凈容器中，在25或冷藏條件下（根據(jù)樣品的儲存條件而定） 于濕度為90%±5% 條件下放置10天，于第5天和第10天取樣，按穩(wěn)定性重點(diǎn)考察項(xiàng)目要求檢測，同時準(zhǔn)確稱量試驗(yàn)前后供試品的重量，以考察供試品的吸濕潮解性能。若

15、吸濕增量5%以上，則在相對濕度75%±5%條件下，同法進(jìn)行試驗(yàn)。若吸濕增重5%以下，其他考察項(xiàng)目符合要求，則不再進(jìn)行此項(xiàng)試驗(yàn)。恒濕條件可在密閉容器如干燥器下部放置飽和鹽溶液，根據(jù)不同相對濕度的要求，可以選擇NaCl飽和溶液(相對濕度75%±1%，15.560)，KNO3飽和溶液（相對濕度92.5%，25）。6.2.3.3 強(qiáng)光照射試驗(yàn) 供試品開口放在裝有日光燈的光照箱或其他適宜的光照裝置內(nèi)，于照度為 4500lx±500lx的條件下放置10天，于第5天和第10天取樣，按穩(wěn)定性重點(diǎn)考察項(xiàng)目進(jìn)行檢測，特別要注意供試品的外觀變化。關(guān)于光照裝置，建議采用定型設(shè)備“可調(diào)光照

16、箱”，也可用光櫥，在箱中安裝日光燈數(shù)支使達(dá)到規(guī)定照度。箱中供試品臺高度可以調(diào)節(jié)，箱上方安裝抽風(fēng)機(jī)以排除可能產(chǎn)生的熱量，箱上配有照度計(jì)，可隨時監(jiān)測箱內(nèi)照度，光照箱應(yīng)不受自然光的干擾，并保持照度恒定，同時防止塵埃進(jìn)入光照箱內(nèi)。此外，根據(jù)藥物的性質(zhì)必要時可設(shè)計(jì)試驗(yàn)，探討pH值與氧及其它條件對藥物穩(wěn)定性的影響，并研究分解產(chǎn)物的分析方法。創(chuàng)新藥物應(yīng)對分解產(chǎn)物的性質(zhì)進(jìn)行必要的分析。6.3 注意事項(xiàng)6.3.1 光照、避光對照、高溫、高濕處理后的固體樣品需混合均勻后再稱量。為消除不同的樣品在相同降解強(qiáng)度下造成的降解程度不一致，先配以高濃度樣品溶液(如有關(guān)物質(zhì)溶液)，再稀釋至檢測方法中要求的進(jìn)樣濃度。6.3.2

17、 酸、堿、氧化降解試驗(yàn)：必須先加稀釋劑使樣品溶解或成懸浮液后，并混搖均勻，再加各降解試劑混勻，放置，盡量避免使樣品干粘在容量瓶的玻璃壁上。6.3.3 無論待測樣品是否是水溶性，各降解處理后的待測樣品，均需檢測其水分或干燥失重含量。比較含量時不應(yīng)只比較濕計(jì)含量，應(yīng)考慮折水或折干計(jì)算。6.3.4 酸、堿、氧化降解試驗(yàn)條件下，為消除不同的樣品濃度在相同降解強(qiáng)度下造成的降解程度不一致，導(dǎo)致質(zhì)量不守恒，在含量和雜質(zhì)檢測時，建議先以樣品溶液濃度高的（如有關(guān)物質(zhì)溶液）做各降解處理，至降解中止后，再稀釋至檢測方法中要求的進(jìn)樣濃度。為盡量減少酸堿氧化降解樣品因不同的進(jìn)樣時間造成的試樣變化，含量和雜質(zhì)檢測可同時采

18、用多臺DAD或PDA儀器并列檢測。6.3.5 考慮到降解后的溶液不夠穩(wěn)定，考察的主要目的是雜質(zhì)的種類及趨勢，所以每種條件下只進(jìn)樣一針即可。6.3.6 不是每一種破壞性條件都使藥物產(chǎn)生降解產(chǎn)物，但一般情況下，很少有一種化合物對每一種破壞性試驗(yàn)條件都穩(wěn)定，因此，可以通過試驗(yàn)，選擇合適的條件，如提高酸、堿、氧化的濃度或者通過加熱等，使藥物降解。降解實(shí)驗(yàn)是否成功的判定標(biāo)準(zhǔn)，在上述各強(qiáng)降解實(shí)驗(yàn)條件下，降解目標(biāo)值達(dá)到5%20%，若超過該值需減緩降解條件，若無法達(dá)到，需說明理由。降解實(shí)驗(yàn)檢測需選用PDA或DAD檢測器來做主峰峰純度分析，無特殊規(guī)定外，峰純度應(yīng)大于99.0%（純度因子應(yīng)大于990）。6.3.7

19、 對于破壞性試驗(yàn)時降解量較大的降解產(chǎn)物，建議結(jié)合穩(wěn)定性研究中加速試驗(yàn)和長期試驗(yàn)的具體雜質(zhì)數(shù)據(jù)，參考ICH對新原料藥中雜質(zhì)的規(guī)定(每日服用最大劑量不超過2克時，鑒定閾值為0.10%;每日服用最大劑量超過2克時，鑒定閾值為0.05%。)，必要時進(jìn)行進(jìn)一步鑒別，并作為已知雜質(zhì)，根據(jù)安全性數(shù)據(jù)，采用已知雜質(zhì)對照，確定合理的限度，訂入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。不能采用已知雜質(zhì)進(jìn)行對照時，可通過測定降解產(chǎn)物、主成分在測定波長處的吸收系數(shù)，分析兩者的差異。若兩者吸收系數(shù)相差較大時，建議采用響應(yīng)因子校正后進(jìn)行有效控制，如果兩者吸收系數(shù)相差較小，建議采用稀釋峰對照法或峰面積歸一化法進(jìn)行有效控制。6.3.8 對于自身對照檢測相關(guān)

20、物質(zhì)的方法，由于樣品可能會被劇烈降解，仍采用自身對照法進(jìn)行計(jì)算會造成計(jì)算結(jié)果的不準(zhǔn)確，在進(jìn)樣時，如果主峰峰高已超載的，改為原樣或標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行同樣濃度的稀釋，如果樣品主峰峰高未超載的，則采用歸一化或歸一化乘以校正因子法計(jì)算結(jié)果。6.3.9 正相色譜法不需要做酸、堿降解、氧化降解實(shí)驗(yàn)，避免對色譜柱的影響。6.4 文件要求6.4.1 降解實(shí)驗(yàn)前根據(jù)預(yù)定的方法必須起草方案。方案的格式同方法驗(yàn)證類文件的格式。6.4.2 對操作中出現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)室偏差應(yīng)進(jìn)行調(diào)查并記錄，應(yīng)記錄實(shí)驗(yàn)所發(fā)生的異常和變更。但類似于降解過程中發(fā)現(xiàn)的由于降解程度過于劇烈，減緩降解條件重新進(jìn)行降解的情況，可不作為偏差，在報(bào)告中描述即可。6.4.3 實(shí)驗(yàn)人員做完實(shí)驗(yàn)后，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)