凱基TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒

1、凱基TUNELffl胞凋亡原位檢測試劑盒凱基TUNELffl胞凋亡原位檢測試劑盒（通用） （BIOTIN標記PODfc，適用于細胞、組織樣本）使用說明書一、TUNE用品說明凱基TUNE佟田胞凋亡檢測試劑盒是用來檢測細胞在凋亡過程中細胞核DNA的斷裂情況，其原理是生物素（biotin ）標記的dUTP在脫氧核糖核甘酸末端轉 移酶（TdT Enzyme的作用下，可以連接到凋亡細胞中斷裂的 DNA勺3 OH末 端，并可與連接了的辣根過氧化酶的鏈霉親和素（ Streptavidin-HRP ）特異結 合，在辣根過氧化酶底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB的存在下，產(chǎn)生很強的顏色反應 （呈深棕色），特異準確地定位正

2、在凋亡的細胞，因而在普通顯微鏡下即可觀 察和計數(shù)凋亡細胞；由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA勺斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細胞樣本（細 胞涂片）的凋亡原位檢測。本試劑盒特點 操作簡便：使用 Ready-to-Use型試劑，并配有 Proteinase K 和DAB 高靈敏度：可以單一檢出初期的凋亡細胞。 高特異性：能特異性染色凋亡細胞。 快速操作：整體操作約需3小時。 用途廣泛：可應用于組織切片、細胞樣本等。 方便觀察：使用光學顯微鏡觀察實驗結果。高正確性：有陽性對照片的制備方法，可以確認試劑盒的有效性 使用注

3、意事項1 .使用前請認真閱讀本說明書，提前準備好相關試劑。2 .因本試劑盒中組分均為微量，使用前請離心集液。3 .為避免試驗誤差、降低試劑的損耗，建議使用精密度高的進口微量移液槍及槍頭。4 . TdT酶反應液最好在使用前根據(jù)樣本數(shù)量集中配制，再分別滴加于各樣本 片上，避免每個樣本單獨配制而產(chǎn)生的試劑損耗。5 .為防止樣本脫落，請使用硅烷(Silane )處 理的載玻片或采用多聚賴氨酸鋪片。6 . 固定好的樣本可以在-20C的70叱醇中放 置30分鐘或至過夜，以改善細胞的滲透性。7 .使用PBS青洗細胞樣本時，不要直接加在細 胞樣本上，以防止細胞樣本的脫落。8 .進行PBS青洗時，以5分鐘清洗3

4、次為標準。9 . DAB為固體粉末，使用前加入 PBS配制成20 X DAB(10 mg/ml)后，按說明 書顯色使用。、TUNEL式齊1J盒組分組份Cat:KGA70220 assaysCat:KGA70350 assaysCat:KGA704100 assays儲存條 件Equilibration Buffer1.0 mL2.5 mL5.0 mL-20 CBiotin-11-dUTP20 p L50 p L100 N L-20 CTdT Enzyme80 p L200 p L400 p L-20 C50x Proteinase K40 p L100 N L200 p L-20 CStrep

5、tavidin-HRP10 N L25 p L50 pL4c避 光DAB2mg5mg10 mg-20 C試劑盒以外自備儀器和試劑 光學顯微鏡、37c孵箱、微量移液器、染色濕盒、蓋玻片、載玻片、染色缸二甲苯、多聚甲醛、PBS HO、TritonX-100、檸檬酸鈉、復染染液：蘇木素 或甲基綠等。三、操作流程概覽細胞涂片、貼壁樣本通左性的促TdT酶的作用下加入Strep光學顯微鏡觀察四、檢測樣本的預處理TUNEL檢測時樣本的預處理是試驗的關鍵所在， 本說明書推薦的條件僅為 普遍情況，用戶需根據(jù)自已的樣本材料及首次試驗結果來調整各個條件（參照 Page 9）,如處理時間、處理濃度等，來優(yōu)化出適合自身

6、樣本的試驗條件，從而 做出客觀的試驗結果。1.細胞樣本的準備自然晾干的細胞樣本（細胞涂片或墨片】（固凝n 4少疹聚甲醛溶于PHT.4的PES申，需鮮盤熱4?的70%乙醺中放置3口分鐘或至過夜,以改善細胞的滲透性PBS漂洗浸入封閉液中，室溫（B25T?） Solomin（封閉海 3%坨6落于甲蹴封閉液配制方法.13。%40?溶于ftnl甲醇浸入通透液中，水上（2-B-C）促港0.l%TnionX-10（l SST嘉髓鮮配部蹦破窗麻二 ifcfi制:loom1水.承閽制好的11mmi的01%»灌蝴中加入O.bniTHmnX-lflO進入標記反應（詳見Page S）操作注意事項:1 .為防

7、止樣本脫落，請使用硅烷（Silane ）處 理的載玻片或采用多聚賴氨酸鋪片。2 .使用PBS青洗細胞樣本時，不要直接加在細 胞樣本上，以防止細胞樣本的脫落。3 .進行PBS青洗時，以5分鐘清洗3次為標準。4 .固定液、PBS封閉液、通透液、染色缸需用戶自備，請按上述方法配制。五、標記和顯色反應頊處理好的樣本PBS漂洗兩次，樣本周圍用唳水里吸干每個樣本滴加打出LTdT箱反應版，配蓋碟片37c避光濕潤反應60由（TdT B6反應液=45 M-L Equilibration Buffer +1U-L BioliBrll-dUIF +4j L TdT Enzjg 需薪鮮宏部陰性對照片不加TdT K&g

8、t;PBS漂洗三次.樣本周圍用吸水紙吸干5 .如果20 X DAB容液顏色變深成為紫色，則不可使用，需重新配制現(xiàn)象可能原因建議6 .蘇木素復染：將切片放入蘇木素染液，染色 30s-10min （根據(jù)樣本做適當調 整），蒸儲水沖洗干凈后放入鹽酸甲醇溶液中 5s,立即用蒸儲水沖洗干凈。分 別用70% 85% 95%無水乙醇浸泡5分鐘。用二甲苯浸泡10分鐘，更換二甲 苯后再浸泡10分鐘。晾干后在切片上加中性樹膠，加蓋玻片。六常見問題的原因及推薦解決方案非特異性染色 （例如:非凋 亡細胞的強染 色）Biotin-dUTP 的非特異性結合勿使細胞干涸在TdT酶反應之后，再用含0.1% Triton X-

9、100 和 1 mg/ml BSA 的 PBSgfc三次。TdT酶的濃度過高用 TdT dilution buffer*作 1 ： 21 ：10稀釋，內(nèi)源過氧化物酶 未被封閉封閉液室溫（15-25 C）封閉10min （封閉 液：3%HO溶于甲醇）光照紫外線導致 包埋試劑的聚合（如:甲基丙烯酸 會導致樣本DNA勺 斷裂）嘗試改用其它包埋材料或其它聚合試劑在固定組織時樣 本DNAG斷裂（內(nèi) 源核酸酶的作用）確保樣品取樣后立即固定或通過肝靜脈灌 注固定固定后某些核酸 酶活性依然較局 導致DN幽裂用含有dUTPffi dAPT的溶液封閉染色背景較高福爾馬林固定導 致某些含黑色素 前體的細胞染成 黃色

10、嘗試以甲醇固定，但可能會降低檢測的敏感 性。內(nèi)源過氧化物酶 未被封閉封閉液室溫（15-25 C）封閉10min （封閉液：3%H2O溶于甲醇）Biotin-dUTP 的非特異性結合在TdT酶反應之后，再用含0.1% Triton X-100 和 1 mg/ml BSA 的 PBSfc三次。樣本被支原體污 染使用支原體檢測試劑盒檢測，如陽性則制備 未被污染的新樣本標記反應試劑（TdT酶及 dUTP 的濃度過高稀釋50%以降低標記反應的濃度細胞處于高度增 殖期在非高增殖期取樣檢測DABW育時間過長減少DA以色時間標記率低、染 色淡至無如果以乙醇或甲 醇固定的樣本則 標記效率較低（因 為在固定時染色

11、 質未能與蛋白質 交聯(lián)，而在操作中 丟失）用溶于PBS PH7.4中的4%T聚甲醛固定或福爾馬林或戊二醛固定。過度的固定導致 與蛋白過度交聯(lián)縮短固定時間，或用溶于 PBS PH7.4的2% 多聚甲醛固定促滲條件不佳，以 致于試劑不能到 達靶分子或濃度 過低增加通透劑促滲時間增加通透劑的作用溫度（15-25 C）優(yōu)化蛋白酶K的作用濃度和作用時間（如:以 400ug/ml 作用 5min）0.1M的檸檬酸鈉70c作用30min。復染信號較弱選擇的染料不合 適用溶于0.1M醋酸巴比妥的3-5%?基綠PH4.0 ,或蘇木素復染陽性對照沒有 信號DNase I的濃度過 低冷凍切片使用3U/mL的DNas

12、e I石蠟切片使用1500U/mL的DNase I一 樣本使用 10U/ml DNase I反應緩沖液：10mMTris-HCl ( PH 7.9) 10 mM NaCl, 5mM MnCb, 10mM CaCl2, 25mMKCl2 , 37c 反應 30 min, PBSgt 去。組織樣本從載 玻片脫落組織樣本被酶從 玻片消化卜來降低蛋白酶K的處理時間*TdT dilution buffer : 60 mM KPB緩沖液(pH7.2) , 150 mM KCl, 1 mM 2-mercaptoethanol , 50 % Glycerol非離子表面活性劑T riton X-100（聚乙二醇

13、辛基苯基醴）免疫細胞化學中，Triton X-100常用濃度 為1%和0.3% ,但通常是先配制成30%的Triton X-100儲備液，臨用時稀釋至 所需濃度。30% Triton X-100 的配制：試齊J: Triton X-100 28.2ml0.1mol/L PBS（pH7.3） 或 0.05mol/l TBS（pH7.4） 72.8ml配制方法：取Triton X-100 及PBS （或TBS）混合，置37c40c水浴中2 3h,使其充分溶解混勻。用前取該儲備液稀釋至所需濃度。Triton X-100是一種非離子型表面活性劑（或稱清潔劑），分子量為646.86（C34H62O11 ）。它能溶解脂質，以增加抗體對細胞膜的通透性。1%的TritonX-100常用于漂洗組織標本，0.3%的Thton X-100則常用于稀釋血清，配制BSA滿加柏l stTeptwidir-HlP工作?6,加蓋殘片37c晶麗窿光反應列min(Streptavidiir-HKP工作液；0.Hl1 2 * 4 L Streptawi_dinr_tikP-|-99.5M-L. PBS)滴加勖A1TOO注工DAB工作液，室溫顯色反應IQminCDAB IfRftc 5U.L ZOXDAB+im SOMt+MU-L FBS 需藉鮮曹觸FB$器洗三次，光學顯微鏡察、拍