對從中國四川泡菜中分離的乳酸菌進行識別和鑒定

1、對從中國四川泡菜中分離的乳酸菌進行識別和鑒定泡菜是傳統(tǒng)的發(fā)酵蔬菜產(chǎn)品，在中國的四川省很受歡迎。本文研究白目的是通過分析來自四川省6個不同地區(qū)的36個樣品來調(diào)查主要物質(zhì)乳酸菌在泡菜中的多樣性（實驗室）。這些樣品的實驗室計數(shù)的記錄是從3.90到8.40cfuml-1 。使用MRSO旨培養(yǎng)基，從這些樣本中獲得總共有185個假定的革蘭氏陽性實驗室和過氧化氫酶缺乏的屬性，這些菌株被發(fā)現(xiàn)在物種水平生理測試上，16srRNA基因測序和PCRT增鑒定。結(jié)果顯示，所有的所分離的乳酸菌都準(zhǔn)確地確定為腸球菌thailandicus（2 株）、乳桿菌（16株）,1.短（24株）,1.paracasei（9株）,l.

2、桿菌（81 株）,l.pentosus（38株）,l.sakei（8株）,l.spicheri（1株）、乳酸明串珠菌（1株）和片球菌屬ethanolidu-rans（5 株）。四川泡菜的主要實驗室l.桿菌，它是從大多數(shù)樣本中分離的。結(jié)果還表明，來自四川省不同地區(qū)的實驗室物種復(fù)雜成分，和這樣一個資源豐富的實驗室菌株為進一步的研究提供原始數(shù)據(jù)涉及益生菌菌株的選擇。關(guān)鍵詞：識別；乳酸菌；泡菜；16srRNA基因序列介紹：泡菜，一種有點咸有點酸的發(fā)酵的蔬菜，四川人已經(jīng)吃了數(shù)百年。由于制作簡單和獨特的風(fēng)味，泡菜很受歡迎，經(jīng)常作為四川主菜的配菜或者開胃菜。自制的泡菜都是基于高度依賴于原材料生存的微生物存在

3、而自然發(fā) 酵，。對于所需酸度和風(fēng)味水平的不同，泡菜的制備過程是很重要的。通常許多蔬菜，如白菜、芹菜、辣椒和蘿卜都是沉浸在6-8%的鹽溶液而紅辣椒，蔥和大蒜在一個特殊的罐子里夏天至少5-7天（約20-27° C）冬天長達 12-16 天（約° C）8-15 日。采收的蔬菜表面上有各種各樣的微生物，雖然蔬菜表面乳酸菌的數(shù)量（實驗室）通常是相對比較低的，在最后的發(fā)酵階段，由于實驗室厭氧和低鹽的條件使其快速增長（Hanetal.,2007）。剛采摘的蔬菜表面所附著的微生物主要是革蘭氏陰性腐生菌（Seoetal.,2010）。在自然發(fā)酵過程的初始階段，實驗室的數(shù)量是低的，使得硝酸鹽還

4、原細菌快速增長（Yanetal.,2008）。在中間階段，腸桿菌科（大腸桿菌、腸桿菌屬等）和芽抱桿菌是低鹽和厭氧條件下，他們逐漸死亡。同時，實驗室菌種快速增殖，產(chǎn)生酸，在厭氧條件下成為優(yōu)勢種和抑制腸桿菌科和芽抱桿菌的生長。發(fā)酵結(jié)束時，大量的實驗室將會控制微生物，使泡菜發(fā)酵保持穩(wěn)定（Karasuetal.,2010;PanagouandKatsaboxakis,2006） 。因此，它是值得實驗室從泡菜中進行分離菌體使泡菜 能都進行工業(yè)化生產(chǎn)。這項研究報告是對來自中國四川省不同地區(qū)的36個樣品品種進行分離和鑒定。185個菌株通過表型特征進行初步鑒定，并且進一步通過16sRNA測序和PCRT增技術(shù)進

5、行測定。材料和方法泡菜樣品的收集，36個樣本的泡菜收集來自四川省的六個不同的地區(qū)，泡菜在抽樣時的溫度范圍從8.7 ° C到16.4。C;平均溫度為13.2。C（表1）,在采樣現(xiàn)場泡菜汁的pH值測定應(yīng)用校準(zhǔn)便攜式酸堿計（美國ExtechpH100）,室溫下，泡菜汁的樣品收集時間為15分鐘，在冰上進行2-5h運輸和樣品到達實驗室后立即進行了微生物分析。計數(shù)和隔離的實驗室稀釋是1毫升的泡菜汁加9毫升生理鹽水（0.9%氯化鈉）。進一步連續(xù)稀釋10倍，范圍是10-5到10-9 ,在 實驗室進行處理和測定，使用布朗甲酚紫 （BCP瓊脂、Nissui制藥、To-kyo、日本）厭氧30°

6、C孵化2天，平 板在30° C用滅菌鍋罐進行滅菌，（巴爾的摩生物實驗室，GasPak100厭氧系統(tǒng)，BD生物科學(xué)，火花，醫(yī)學(xué)博士， 美國）。菌落是從MR流養(yǎng)基上隨機地挑取， 每個平板含有30-300個菌落，（ManRogosaSharpe液體培養(yǎng)基，丙烯酰胺)，并轉(zhuǎn)移到 5ml的MRS夜體培養(yǎng)基中，選中平板上的菌落在MR流養(yǎng)基上進行反復(fù)純化，革蘭氏陽性和過氧化氫陰性酶是從純化的平板中提取，在 -80。C, 10%(w/v)脫脂牛奶進行冷凍儲存。凍干隔離進行長時間存儲。實驗室常規(guī)鑒別，進一步鑒定革蘭氏陽性和過氧化氫陰性酶，是由使用以下物理方法進行分離從精氨酸氨生產(chǎn)；二氧化碳是從倒杜倫管

7、中的含有葡萄糖的MRS夜體培養(yǎng)基中提取，Tablel. GeneralfeaturesofpicklesamplesfromsixdifferentregionofSichuan.SiEi pHvalueMainmateriallocationumbern(° C)(logcfuml -1)0.3 5.541.491to3Chengdu(15.5?16.4) (3.5?4.0) (4.15?7.11)summerradish13.1 ±0.53.4 ±0.2 6.95 ±0.714to7Chongzhou(12.6?13.5) (3.

8、2?3.5) (5.99?7.69)celery,cowpea,cabbage,bambooshoots12.3 ±1.73.7 ±0.4 6.65 ± 1.34summerradish,celery,cowpea,cabbage,Ch inese8to19Dayi(8.7?15.1)(3.5?4.5) (3.90?8.17)cabbage14.5 ±1.53.8 ±0.6 6.82 ± 1.51summerradish,celery,cowpea,cabbage,ba mboo20to25Pujiang(11.5?15.3) (3.

9、2?4.5) (4.89?8.26)shoots13.2 ±1.33.5 ±0.4 6.26 ± 1.09summerradish,celery,cowpea,Chinesecab bage,26to34Qionglai(11.9?15.3) (3.0?4.2) (4.36?7.54)carrot11.6 ±0.83.7 ±0.9 7.73 ±0.95summerradish,cowpea,celery,cabbage,ca psicum35to36Xinjin(11.0?12.2) (3.0?4.3) (7.05?8.40)frut

10、escensAverage13.2 ±1.73.6 ±0.4 6.58 ±1.25分別在10° 0,15° 0,45° C和50° C的情況下在 MRS夜體培養(yǎng)基中生長 5天，在pH值為3.0,3,5,4,0,4,5,5,0,9.0 和9.6的情況下在MRS夜體培養(yǎng)基中生長 3天，MR沸養(yǎng)基中的耐鹽度為含有 2.0%3.0%,4.0%,6.0%,6.5%,8.0% 和10.0%氯化鈉(w/v)，在分離菌種的溫度下培養(yǎng)3天(Ko-zakietal.,1992;Yuetal.,2011)。用一套商業(yè)工具通過D和L乳酸產(chǎn)生葡萄糖同

11、分異構(gòu)體的類型和數(shù)量來改變MR沸養(yǎng)基。(霍夫曼羅氏診斷,Mann-heim,德國)。碳水化合物發(fā)酵試驗由根據(jù)Jayne-Williams 描述的方法(1975)。26種碳水化合物通過使用糖基與氯酚紅湯作為指標(biāo)進行了測試。不同糖被添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基用來改變培養(yǎng)基，以最終濃度為0.5%(w/v)。碳水化合物發(fā)酵的結(jié)果檢查是根據(jù) Bergey系統(tǒng)細菌學(xué)手冊(KandlerWeiss,1986)中所提供的信息。16srRNA基因測序和親緣關(guān)系分析，總基因組的DN端從5ML整夜培養(yǎng)的培養(yǎng)基中提取，溫度設(shè)定為37。C,通過先前的方法(Yuetal.,2009)。純化DN蹴度稀釋到最后的100ng/以用來測定

12、。16srRNA基因放大使用 引物(GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG)and16S-RA(AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTT( A)由sun進行描述等等(2010)核甘酸1至21是16S-FAand16S-RA特定的測序引物，分別地， 16srRNA的 基因?qū)嶒炇以谧詣訜嵫h(huán)被放大(ptc-200;MJ 研究，沃爾瑟姆，美國)每個樣本包含 1XTaq緩沖區(qū)(Ta-KaRaBio-Co。、志賀、日本)、1.5毫米MgCl20.2科M每個核甘酸,10pmol每個引物,10ng細菌的DNA|莫 板和1.0U前任Taq

13、TM聚合酶(豆類Bio-Co)。反應(yīng)條件如下:5分鐘94° C,94° C1分鐘,1分鐘58° 0,72 ° Cetalal.,2007),一個序列比對和 phyloge-netic 樹創(chuàng)建基于 neighbor-joining(NJ) 方法。l.桿菌組的辨別，為進一步班別菌株l.桿菌組，進行多重PCRM定recA基于基因的引物：paraF(5 '-GTCACAGGCATTACGAAAA0-pentF(5 ' -CAGTGGCGCGGTTGATATQ-planF(5 ' -CCGTTTATGCGGAACACCTA-,3和上一頁(5

14、 ' -TCGGGATTACCAAACATCAC-3 PCRmix-ture 和 amplifi 陽離 子進行所述 Torrianietal 。 (2001)。結(jié)果計數(shù)和分離的實驗室泡菜樣品的pH值范圍從3.2到4.5(表1)。實驗室的可行樣品的數(shù)量都顯示在表1。實驗室36種泡菜樣品在BCP瓊脂培養(yǎng)基不同 cfuml-1范圍從3.90到8.40。從成都，Chongzhou,大邑，浦江,Qionglaia 新津縣地區(qū) 實驗室計數(shù)分別為 5.54 ±1.49,6.95 ±0.71,6.65 ± 1.34,6.82 ±1.51,6.26 ±

15、1.09,1.09 ± 7.73 日志 cfuml-1, 分別。革蘭氏陽性和過氧化氫陰性細菌生長的MR麗培養(yǎng)基被認為是假定的實驗室，和185個假定實驗室分離出36泡菜樣品。Vol.58YUetal.Table2.PhenotypiccharacteristicofLABisolatedfromnaturalfermentedpickleinSichuanProvinc e,China.CharacteristicsaGroups123456789Numberofisolates1624911981125ShapeRRRRRRCCCGasfromglucose-+-+-Lacticac

16、idisomer bLDLLDLDLDLDLDLNHfromarginine-+-+-+-GrowthatpHvalue30c000000003.50068900003415249119411054.516249119511055.016249119511259.0009110511209.6000001020GrowthinNaCl(w/v)2.0%16249119511253.0%16249119511254.0%16249119511216.0%16109119511206.5%1007119510208.0%300895000010.0%000020000Growthattempera

17、ture(C)10142491190100115162491195112545003925012550000000000AcidfromD-Arabinose16240050000L-Arabinose162404350000D-Cellobiose160911950125Esculin1612911950125Galactose1624911950125Gluconate1624911950020D-Lactose022811950024D-Mannitol00811900020D-Mannose160911950125D-Melezitose00811300000D-Melibiose02

18、4011950100D-Raffinose021011900100L-Rhamnose0001300004Ribose1624911951120Salicin160911950125D-Sorbitol00911950000L-Sorbose009000000D-Sucrose1614911950125D-Trehalose160911950005D-Xylose02403801100AllstrainsfermentedD-glucose,D-fructoseandD-maltose.Nostrainsfermentedinulin,starch,xylitol orglycogen.aGr

19、oups1to9wereident幣edasLactobacillusalimentarius , L.brevis , L.paracasei , L.plantarum , L.sakei, L.spigeri , Leuconos-toclactis, Enterococcusthailandicus。 ,and Pediococcusethanolidurans ,respectively. L:L-lacticacid,DL:DL-lacticacid,D:D-lacticacid.cNumberofpositivestrains.傳統(tǒng)鑒定實驗室根據(jù)形態(tài)、生理和生化特性,185株被分

20、成9組（表2）。所有分離的菌種在 pH值5.0,15 °C,2.0%,3.0%氯化鈉進行生長，是 15° C而不是50° C或pH值3.0,使他們能發(fā)酵葡萄糖、 果糖和D-麥芽糖但不是菊粉，淀粉、木糖醇或糖原。十六個隔離組1被確定為l.硝化菌基于 生理生化特性（路透社，1983）。他們生產(chǎn)L-乳酸，但不能從葡萄糖或氨精氨酸產(chǎn)生二氧化碳。大多數(shù)分離菌種生長良好 ,10 ° C,pH值4.0和4.5,6.0%和6.5%生理鹽水，但只有3株可以生 長在8.0%氯化鈉。這些菌株可以利用 D型和L型阿拉伯糖、核糖、半乳糖，甘露糖、七葉靈， 水楊甘，纖維二糖,D蔗糖

21、,D-海藻糖和葡萄糖酸。組 2包才24桿狀隔離,D乳酸產(chǎn)生，并可能 產(chǎn)生二氧化碳從葡萄糖和 NH3精氨酸。菌株可以增長10° C,pH值4.0和4.5,4.0%的氯化鈉。 除了 10隔離未能增長6.0-10%氯化鈉。大多數(shù)分離菌株可以發(fā)酵 D型和L型、核糖D-木糖， 半乳糖，七葉靈,D乳糖,D蜜二糖，D蔗糖D-raffi糖，葡萄糖酸。這些菌株1.由于其短小的 特征。菌株3組達到產(chǎn)酸但不能產(chǎn)生二氧化碳和氨 ，生長良好,pH值3.5,4.0,4.5,9.0,4.0%,6.0% 和6.5%氯化鈉，在10° C。這些分離株能產(chǎn)生酸的糖除了 D蜜糖 D-乳酸，L-乳酸L-鼠李糖,D-

22、raffi 糖和D-木糖?？紤]到所有的因素，這組被確定為 l.干酪 乳桿菌組。一百一十九組隔離 4被發(fā)現(xiàn)與l.植物乳桿菌密切相關(guān)。他們生產(chǎn) DL乳酸但不能 從葡萄糖或氨精氨酸產(chǎn)生二氧化碳。多數(shù)能生長在3.5 ° C和45° C, ph為4.5、4、和6%10、 6.5%和8%勺氯化鈉中，。所有菌株可利用阿拉伯糖，阿拉伯糖、核糖、半乳糖、 D-甘露糖、D-山梨醇、纖維二糖、 D-乳糖、D-密二糖，、海藻糖、葡萄糖酸產(chǎn)酸產(chǎn)氣。一株屬于6組歸類為L.spicheri 基于自身的特性（merothetal. , 2004）,其中包括生產(chǎn)乳酸，氣由精氨酸而不是葡萄糖，這種 菌株可以在

23、10° C, pH值4, 4.5 , 9和9.6 ,和4% 6嘀口 6.5%的NaCl增長，但僅能發(fā)酵核 糖、木糖。7組的菌株屬于屬leuconosTOC,產(chǎn)生乳酸和發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生氣體，但不水解精 氨酸。該菌株能生長在溫度45度，pH4, 4.5和9, 4嗨口 6%勺NaCl,利用核糖、木糖、半乳糖、D-甘露糖、秦皮甲素、水楊酸、纖維二糖、D-密二糖、蔗糖和d-raffi 鼻子。雙球菌組8, iDEN 蒂菲為腸球菌屬，產(chǎn)生乳酸而不能從葡萄糖產(chǎn)氣。他們可以生長在45° C, PH值為4.5 , 9和9.6 ,在4% 6噴口 6.5%氯化鈉。這些菌株能夠利用半乳甘露糖、核糖、東

24、星、秦皮甲素、 水楊素、甘露醇、d-cello-biose , D-乳糖，蔗糖和葡萄糖。五球菌9組確定為戊糖片球菌屬基于糖發(fā)酵試驗。他們生產(chǎn)的乳酸，但不能產(chǎn)生氣體從葡萄糖或精氨酸。大多數(shù)菌株生長良好，在45° C和pH值為3.5、4和4.5 ,只有一株可以在 4%勺NaCl在10的增長。他們可 以利用半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、秦皮甲素、水楊酸、纖維二糖、D-乳糖、蔗糖和海藻糖。 16SrRNA基因測序和系統(tǒng)發(fā)育分析確認的物種，對所有菌株的16S/）。得到的序列（約 1400bp）沉積在GenBank登錄號分別為：分以下gu125423, gu125424,和gu125427?谷12

25、5609。系統(tǒng)進化樹分析顯示的16SrRNA基因序列之間的關(guān)系代表菌株及相關(guān)型菌株利用MEGA：件（圖1）。1組應(yīng)變imau80014是L.阿里 mentariusDSM20249t密切相關(guān)（m58804）具有99.7%的同源性 20249tL.法典DSM（m58804）。應(yīng)變 imau80001 組 2 和型菌株 ATCC14869tL.brevis（gu125423）聚為一個相似的99.8%組。3組應(yīng)變imau80040放在副干酪乳桿菌 JCM8130t集群（d79212）具有100%的相似性。代表菌株 imau80002和4組出現(xiàn)一樣都與植物乳桿菌ATCC14917tL.imau8000

26、5（aj965482 ）和L.戊糖乳桿菌JCM1558t （d79211）,和16SrRNA基因序列分析表明有 99.9% 的相似性屬植物乳桿菌ATCC14917t（aj965482 ）和99.8%L.戊糖乳桿菌 JCM1558t （d79211）。5組應(yīng)變imau80073是L.sakeiDSM20017t密切相關(guān)（am371184）和他們共享 99.8%的同源性。 6 組應(yīng)變 imau80039 是 L.spicheriLTH5753t密切相關(guān)（aj534844 ） 100呢|導(dǎo)分析。7組和 8組分 imau80024Leu 應(yīng)變 imau80137。鏈球菌和腸球菌（JCM6123tab0

27、23968） thailandicusKCTC13134t（ef197994 ）,和 16SrRNA基因序列顯示100%勺相似性型菌株。9組應(yīng)變imau80011接近片球菌 ethanoliduransLMG23354t（ay956789）和他們共享 100%勺同源性?；?6SrRNA基因序列分析，177桿分離泡菜準(zhǔn)確地分配給 5種1組，即L.brevis （24株）、副 干酪乳桿菌（9株），L.法典（16株），L.sakei （8株），L.spicheri （1株）和植物乳桿 菌組（119株），這些結(jié)果是一致的表型特征的結(jié)果。此外，8球菌均為大腸thailandicus（2株），P.eth

28、anolidurans （5株），和亮氨酸。鏈球菌（1株）；然而，這些菌株均難 以確定的物種水平的表型特征。多重聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果多重聚合酶鏈反應(yīng)是用來區(qū)分密切的 植物乳桿菌組相關(guān)的物種。對擴增產(chǎn)物的大小分別為318bp的預(yù)期為植物乳桿菌，218bp和107bp的L.L.戊糖乳桿菌paraplantarum 。 81株集團3型菌株植物乳桿菌 ATCC14917t產(chǎn)生 318bp的產(chǎn)品，而38株和型菌株L.戊糖乳桿菌JCM1558t產(chǎn)生218bp的產(chǎn)品（圖2） 討論泡菜是使用傳統(tǒng)的和古老的自然發(fā)酵法。這種獨特的方法可以有效地保留有益微生物，傳統(tǒng)微生物對泡菜生產(chǎn)的一個主要的角色，特別是獨特的風(fēng)味和

29、FL的益生特性。在這項研究中，我們確定了組成實驗室和描述的表型和基因型四川泡菜中的特性。從不同地區(qū)的泡菜樣品中觀察到的實驗室中的可行計數(shù)的輕微變化四川省。泡菜平均數(shù)來自崇州、大邑、蒲江和邛味的樣品低于新津的樣品，略高于成都的樣品，和四川泡菜汁實驗室平均值6.58 士1.25CFUmL-1的日志。因為原料和泡菜溫度在六個地區(qū)不同（表 1）,所以我們認為實驗室 的這種差異計數(shù)可能與蔬菜的種類有關(guān)，泡菜的來源和溫度。一百八十個網(wǎng)絡(luò)實驗室被隔離泡菜樣品，所有菌株分為9根據(jù)生理特性，營養(yǎng)需求和生長的常規(guī)方法組條件。然而，基因 型分析表明所有這些菌株被確定為10種。根據(jù)生理特性，在 7組，8株9是確定屬于

30、腸球菌屬（2株），屬明串珠菌（1株）和屬片球菌（5株），和16SrRNA基因序列分析表明， 代表菌株形成一個良好定義的集群類型株在系統(tǒng)進化樹。此外，4組菌株確定為屬于植物乳桿菌組（119菌株）的表型特征的基礎(chǔ)上，他們16SrRNA基因序列顯示99.8%的相似性植物乳桿菌、戊糖乳桿菌 L.。ennahar等人。（ 2003）報道稱，植物乳桿菌和 L.戊糖乳桿菌有 很類似的16SrRNA基因序列相差只有 2英國石油。在本研究中，應(yīng)用多重聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù) 對這2種植物進行了鑒別顯示81株從4組確定為L.植物乳桿菌、戊糖乳桿菌，38株L.。傳統(tǒng)的表型特征往往會產(chǎn)生變量為密切相關(guān)的實驗室鑒定結(jié)果（柳田稔etal. , 2007）;因此表型特征和分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，準(zhǔn)確地在物種水平鑒定實驗室。不同樣本間的分離分布在表3。的主要菌株。植物乳桿菌（43.8%）是從所有采樣分離網(wǎng)站和大多數(shù)樣品，和 L. 戊糖乳桿菌（20.5%） , L.群（13%和L （8.6%）是從法典的采樣點分離。其他物種隔離與 相對較低的頻率，包括副干酪乳桿菌，L.sakei , L.spicheri ,P.ethanoliduransthailandicus , E.,亮