核酸分子雜交與應(yīng)用ppt課件

1、核酸分子雜交：來源一樣或不同的DNA甚至DNA與RNA分子變性后，在適宜的條件下經(jīng)過堿基互補構(gòu)成雙鏈雜交體的過程稱核酸分子雜交(molecular hybridization)。核酸分子雜交技術(shù)是目前生物化學和分子生物學研討中運用最廣泛的技術(shù)之一，也是臨床分子檢驗的重要技術(shù)。核酸探針的標志探針(probe)是指用放射性核素或其它標志物標志的核酸片段。標志物放射性標志非放射性標志生物素標志地高辛標志熒光素標志探針的種類 DNA探針：雙鏈或單鏈DNA探針是最常用的核酸探針。長度在幾百堿基對以上。DNA探針又分為： 基因組DNA探針：有細菌、病毒、原蟲、真菌、動物和人類細胞DNA探針，多為某一基因的

2、全部或部分序列，或某一非編碼序列。 cDNA探針：以mRNA為模板經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄酶催化產(chǎn)生的互補于mRNA的DNA鏈。探針的種類 DNA探針優(yōu)點： 1、普通克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限繁衍； 2、DNA探針不易降解 3、DNA的標志方法比較成熟。探針的種類 RNA探針：可以是標志分別的RNA，也可以是重組質(zhì)粒在RNA聚合酶作用下的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。其優(yōu)點是： RNA探針為單鏈，復雜性低，與靶序列雜交反響效率極高 因不存在反復序列，因此特異性高 本底低 缺陷：探針的種類 寡核苷酸(oligo)探針：由1750mer組成的短探針。 優(yōu)點： 可根據(jù)需求人工合成相應(yīng)的序列； 因片段短，只需一個核苷酸突變，其Tm值也

3、有明顯變化，特別適用于點突變的檢測 雜交速度快特異性強 缺陷：所帶標志物少靈敏度低；片段短雜交體不穩(wěn)定探針的標志 切口平移法 標志原理：是目前實驗室是最常用的一種脫氧核糖核酸探針標志法。利用大腸桿菌DNA聚合酶1的多種酶促活性將標志的dNTP摻入新合成DNA鏈中使探針被標志。 帶缺口(nick)的線狀、超螺旋及環(huán)狀雙鏈DNA均可作為切口平移法的模板。DNase IDNA Pol I,-32P-dNTP標志步驟 1、取1gDNA溶于少量無菌蒸餾水中 2、參與l10 x切口平移緩沖液，混勻 10 x切口平移緩沖液 0.5mol/L Tris.Cl(pH7.2) 0.1mol/L MgSO4 1mm

4、ol/L 二硫蘇糖醇(DTT) 500g/ml 牛血潔白蛋白標志步驟 3、參與除標志核苷酸外的其他三種脫氧核糖核苷酸溶液(也可以是多種標志核苷酸)，20mmol/L溶液各1l。 以下操作要在同位素任務(wù)室中有防護措施的情況下進展操作 4、參與100Ci(10l)標志的核苷酸溶液。注：應(yīng)儲存在20oC冰箱中，運用前在室溫下放置1530分鐘融化。要盡量減少凍融次數(shù)。標志步驟 5、參與無菌蒸餾水，至終體積為46.5l，混勻 6、參與0.5l稀釋的DNase I溶液，混勻 7、參與1l(5U)DNA聚合酶I溶液，混勻 注：以上操作均在冰浴中進展 8、置1416oC水浴中保溫12小時 9、參與2l 0.5

5、mol/L EDTA終止反響 10、純化標志的DNA探針單鏈DNA探針的標志探針的標志 隨機引物法 標志原理：隨機引物是含有各種能夠陳列的寡聚核苷酸片段的混合物，可以與任何核酸序列雜交，起到聚合酶促反響的引物作用。將待標志的探針模板與隨機引物一同退火，合成標志探針。標志步驟 1、冰浴中，在一微量離心管內(nèi)順序參與以下溶液，并混勻 20mmol/L DTT 1l 5mmol/L dATP、dGTP、dTTP 1l 10 x隨機引物緩沖液 1l 標志dCTP 3l 水 1l標志步驟 2、取200ng雙鏈DNA溶于1l蒸餾水中，在蠟?zāi)ど吓c1l隨機引物充分混勻，吸入一毛細玻璃管中，用火封嚴兩端。置沸水浴

6、中30分鐘并迅速置冰水浴中1分鐘。將DNA轉(zhuǎn)入上述離心管中 3、參與1l(5U)DNA聚合酶Klenow片段，混勻并離心，室溫反響3小時以上標志步驟 4、取10l終止緩沖液，置20oC保管備用 終止緩沖液 50mmol/L Tris.Cl(pH7.5) 50mmol/L NaCl 5mmol/L EDTA 0.5% SDS隨機引物標志法特點 1、除能進展雙鏈DNA標志外，也可用于單鏈DNA或RNA探針的標志。當用RNA為模板是，操作方法同上，但必需采用反轉(zhuǎn)錄酶。 2、標志活性高，只需25ng樣品DNA，可在3小時內(nèi)使4060以上甚至90的標志dNTP摻入到探針DNA鏈上 3、操作方便3末端標志

7、末端標志屬于部分標志。特點是可得到全長DNA片段，但標志活性不高。3末端標志法包括限制酶切和聚合酶合成兩個過程，3標志有兩種方式：大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段末端標志法T4DNA聚合酶標志法大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段末端標志法：標志反響步驟：(1)在反響管中依次參與以下試劑并混勻 DNA 1g 10 xKlenow片段緩沖液 2l 2mmol/L3種dNTP(無dATP) 1l -32PdATP 30Ci 加水至 25l 10 xKlenow片段緩沖液 2l 0.5mol/L Tris.Cl(pH7.2) 0.1mmol/L MgSO4 1mmol/L DTT(二硫蘇

8、糖醇) 500g 牛血潔白蛋白(2)參與1單位Klenow聚合酶片段，室溫反響30min。(3)參與12l0.5mol/LEDTA以終止反響。酚/氯仿抽提1次。(4)Sephadex G50柱層析或乙醇沉淀法分別標志的DNA片段。大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段末端標志法：本卷須知：(1)要根據(jù)不同限制酶產(chǎn)生的不同粘性末端選擇不同的標志核苷酸。(2)選擇適當?shù)南拗泼讣?32P-dNTP,利用DNA聚合酶I Klenow片段的末端填充活性，可以選擇性地將DNA雙鏈之中一條鏈特異地標志。(3)此方法不能直接用于3凸出末端DNA的標志。CCTAGGAATTCAATTCCCTAGG EcoR

9、I BamH I參與DNA聚合酶，dNTP(其中一種為標志核苷酸)AATTCCCTAGGT4DNA聚合酶標志法T4DNA聚合酶具有兩種功能，53聚合活性 和35外切活性。當反響體系中缺乏dNTP時，T4DNA聚合酶主要表現(xiàn)為外切酶活性。利用這一特性可產(chǎn)生5凸出的DNA片段，然后參與dNTP，其中之一為標志核苷酸，在T4DNA聚合酶活性的作用下，合成出標志探針。T4DNA聚合酶，無dNTP參與dNTP,其中一種為標志核苷酸標志反響步驟：(1)在反響管中參與以下試劑并混勻 DNA 0.20.5g 1xT4DNA聚合酶緩沖液 2l 加水至 20l(2)參與所需的限制酶，并在適當條件下溫育(3)參與適

10、量T4DNA聚合酶。 (4)當切除了所需數(shù)量的核苷酸后，參與 1l2mmol/L四種核苷酸(其中一種為標志核苷酸)，37oC保溫一小時。(5)Sephadex G50柱層析或乙醇沉淀法分別標志的DNA片段。5末端標志標志原理：在T4多核苷酸激酶的催化下，可使 ATP分子上的磷酸基團轉(zhuǎn)移到DNA或RNA分子的5OH基團上。因此采用-32P-ATP為底物，即可將DNA樣品5端標志。但核酸樣品5端必需是去磷酸的。PP磷酸酶T4多核苷酸激酶ATPPP標志反響步驟：(1)堿性磷酸酶的預處置：堿性磷酸酶(CIP)硫酸銨懸液4oC下在Eppendorf離心管中離心1分鐘。棄上清，沉淀重溶于少量水中。4oC下

11、此溶液可保管一個月以上。(2)將DNA樣品溶解于少量10mmol/L tris.Cl(pH8.0)溶液中，然后參與： 10 xCIP緩沖液 5l CIP緩沖液 適量 加水至 48l置37oC30分鐘。參與第二份CIP，繼續(xù)保溫30分鐘，即可脫去5端磷酸基團。0.01U的CIP，可脫去1pmol5磷酸基團(1.6g4kb線性DNA的5端數(shù)相當于1pmol)。 10 xCIP緩沖液 Tris.Cl(pH9.0) 10mmol/L MgCl2 1mmol/L ZnCl2 10mmol/L 亞精胺(3)參與40l H2O，10l 10 xSTE，5l 10SDS。加熱至68oC，15分鐘。 10 xS

12、TE 100mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 1mol/L NaCl 10mmol/L EDTA酚/氯仿及氯仿各抽提兩次除CIP，SephadexG50層析脫鹽后乙醇沉淀。取脫鹽后的脫5磷酸DNA150pmol溶于少量水中，然后參與以下試劑進展5末端標志：加水至50ul，混勻，37oC保溫1小時。參與2ul0.5mol/LEDTAz終止反響，酚/氯仿抽提后乙沉淀。SephadexG50層析分別后得5標志的DNA探針。-32P-ATP 50pmol(150uCi)T4多核苷酸激酶 1020U10 x激酶緩沖液 10ul本卷須知：(1)T4多核苷酸激酶對多種雜質(zhì)非常敏感，要求必需到達一定

13、的純度；脫磷酸后要用SephadexG50層析除去小分子及離子。(2)亞精胺即可促進-32P-ATP的摻入，又能抑制核酸酶的活性 。(3)脫磷酸的DNA樣品最好經(jīng)電泳純化以除去其中存在的低分子質(zhì)量的核酸，否那么會競爭性抑制目的DNA的標志 。探針的線純化凝膠過濾柱層析法利用凝膠的分子篩效應(yīng)，將標志的DNA與小分子彼此分開。因標志的探針量很小，普通用離心柱層析法。乙醇沉淀法核酸分子雜交的種類和方法核酸分子雜交的根本原理：DNA分子由兩條互補的單鏈構(gòu)成的雙螺旋構(gòu)造。維持構(gòu)造穩(wěn)定的力有三：1、兩條鏈間互補堿基的氫鍵；2、堿基間的堆積力(范德華力)；3、中和鏈內(nèi)的負電荷。變性：在理化要素作用下，雙螺旋

14、構(gòu)造間的氫鍵斷裂，兩條鏈解開構(gòu)成單鏈的過程。變性溫度(Tm)：核酸分子熱變性時，從開場變性到變性終了，是在一個很窄的溫度范圍內(nèi)進展的，當變性進展到核酸分子解鏈一半時的溫度，稱變性溫度，也稱融解溫度。影響變性的要素：1、堿基組成 DNA分子中GC含量越高Tm越高。在1SSC溶液中，兩者之間的關(guān)系可以用閱歷公式表示： Tm(G+C)%0.41+69.3其中，69.3為無GC存在時的Tm值。(G+C)%每添加1，Tm約上升0.41oC。影響變性的要素：2、溶液的離子強度 DNA鏈骨架上的磷酸基團帶有較多的負電荷，它們之間的靜電相斥作用是其雙鏈的不穩(wěn)定要素之一。在無鹽的水中，DNA在室溫下就會變性，參

15、與鹽后，正離子可以封鎖磷酸基團的負電荷，使DNA穩(wěn)定性添加，Tm值升高。影響變性的要素：3、pH值 pH值在59范圍內(nèi)，Tm值變化不明顯。在高pH值下，可使堿基失去構(gòu)成氫鍵的才干。當pH大于11.3時一切氫鍵均被破壞，DNA完全變性。4、變性劑 可以干擾堿基堆積力和氫鍵的構(gòu)成，因此可以降低Tm值。常用的變性劑是甲酰胺和脲，通常用50的甲酰胺以使Tm值降低30 oC 。復性：變性核酸分子在適宜的條件下重新構(gòu)成雙螺旋構(gòu)造的過程稱復性。熱變性的DNA溶液在低于Tm值25 oC的溫度下維持相當長的一段時間，那么可使之恢復到天然的雙鏈構(gòu)造形狀。復性的速度受以下要素影響：1、DNA濃度 DNA濃度越大復性

16、速度越快；2、DNA的分子質(zhì)量 大分子質(zhì)量的DNA分散速度慢，復性速度慢；3、溫度 溫度過高，有利于DNA變性而不利于復性；4、離子強度 5、DNA分子的復雜性 DNA總量一定時，基因組越復雜，其中特定順序的拷貝數(shù)越少，互補順序的濃度越低，復性反響速度越慢。分子雜交技術(shù)就是利用了核酸分子的變性與復性原理，使變性的核酸分子與檢測核酸分子在堿基互補的條件下構(gòu)成雜交雙螺旋的過程。探針(probe)：在核酸變性實驗中，為使雜交體與單鏈核酸分子區(qū)分開來所運用的帶有標志的單鏈核酸分子。核酸分子雜交分類：以雜交分子分類：DNA與DNA雜交；DNA與RNA雜交；RNA與RNA雜交。以探針標志分類：以雜交介質(zhì)分

17、類：液相雜交與固相雜交。固相雜交：菌落雜交、Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、原位雜交及基因芯片等技術(shù)。液相雜交(solution hybridization)：是一種比較原始的分子雜交技術(shù)。待測分子與探針在雜交液中完成反響，利用層析方法將雜交分子與末雜交分子分開后用液閃儀進展計數(shù)或利用紫外吸收特性變化分析雜交結(jié)果的分子雜交類型。液相雜交又分為：RNA酶維護分析法、核酸酶S1維護分析法。RNA酶維護分析法(RPA)：利用RNase A和RNase T1能專注性降解單鏈RNA而雙鏈RNA遭到維護的特點，用體外轉(zhuǎn)錄合成的放射性標志的RNA探針與待檢mRNA 進展液相雜交，使互補序

18、列RNA探針和待測RNA構(gòu)成雜交體，用RNase降解非雜交部分RNA后分析雜交結(jié)果。RNA酶維護分析法的運用：mRNA定量mRNA未端定位內(nèi)含子在相應(yīng)基因中的位置RNA酶維護分析法的主要步驟：1、制備待測RNA 從細胞或組織中提取總RNA或mRNA；2、RNA探針標志 采用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備和標志探針；3、分子雜交：將待測樣品RNA和RNA探針在液相中雜交，雜交前將樣品和探針變性，破壞二級構(gòu)造；4、RNA酶消化單鏈RNA；5、電泳分析雜交分子。核酸酶S1維護分析法(nuclease S1 protection assay)：原理與RNA酶維護分析法的原理類似，核酸酶S1能專注性地降解單鏈DNA

19、和RNA，而不能降解DNA/RNA雜交雙鏈。采用M13體系克隆和擴增特定基因的單鏈DNA片段，在合成過程中參與核素標志物，即可合成出高放射性的單鏈DNA探針。將探針與待測RNA樣品在液相中進展雜交，構(gòu)成DNA/RNA雜交雙鏈。酶解后進展分析。核酸酶S1維護分析法可用于基因轉(zhuǎn)錄起始位點分析及內(nèi)含子剪切位點分析。液相雜交的優(yōu)點：設(shè)備簡單、操作方便。液相雜交的缺陷：過量未雜交探針難以除去，產(chǎn)生高背景；同源與異源核酸均可構(gòu)成雙螺旋構(gòu)造使得雜交結(jié)果難以分析。固相雜交：將欲分析的樣品先結(jié)合在固相支持物上，再與探針進展雜交反響。雜交結(jié)果可用儀器或放射自顯影技術(shù)分析雜交結(jié)果。固相支持物的選擇：可用于固相支持物

20、的種類很多。一種良好的固相支持物應(yīng)具備以下幾個特性：1、具有較強的結(jié)合核酸分子的才干；2、與核酸分子結(jié)合后不影響與探針的結(jié)合；3、與核酸分子的結(jié)合穩(wěn)定結(jié)實；4、非特異性吸附少；5、具有良好的機械性能便于操作。硝酸纖維素濾膜優(yōu)點：具有較強的吸附單鏈DNA或RNA的才干，特別是在高鹽濃度下，其結(jié)合才干可達80100 g/ cm2。吸附的單鏈核經(jīng)真空烘烤后，依托疏水性相互作用而結(jié)合在硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜具有雜交信號本底低的特點廣泛用于各種雜交實驗。缺陷：與單鏈核酸的結(jié)合才干不非常結(jié)實，尤其是小于200bp的DNA片段，洗膜時(特別是在高溫下)DNA會出現(xiàn)脫膜景象，硝酸纖維素膜質(zhì)地較脆使操作不

21、便。尼龍膜：是目前較理想的一種核酸固相支持物，它有多種類型，不同類型的膜上網(wǎng)孔大小不同。經(jīng)正電荷基團修飾后與核酸的結(jié)合力更強。尼龍膜與核酸的結(jié)合才干為350500 g/ cm2。經(jīng)烘烤或紫外線照射后，特別是紫外線照射，核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上帶正電荷的基團相互交聯(lián)，使結(jié)合更加結(jié)實。Southern印跡雜交：Southern 印跡雜交過程1、DNA樣品的酶切和電泳2、電泳膠的處置3、DNA的轉(zhuǎn)移4、DNA的固定5、DNA膜的雜交雜交過程1、預雜交：為了減少非特異性雜交反響，在雜交前應(yīng)進展預雜交，將非特異性DNA位點封鎖。常用的封鎖物有兩類：其一是變性的非特異性DNA，大多采用鮭魚精子DNA或

22、小牛胸腺DNA；其二是一些高分子化合物，其作用有二：封鎖DNA上的非特異位點；封鎖膜上與非特異性DNA結(jié)合位點。預雜交液的配制6SSC1SSC為0.15mol/L NaCl和 o.o15mol/L檸檬酸5Denhardts溶液0.5SDS100g/ml變性的鮭魚精子DNA50甲酰胺(可不用)50Denhardt：聚蔗糖(Ficoll 400) 5g聚乙烯吡咯烷酮 5g牛血潔白蛋白(組分V) 5g加水至500ml，分裝后保管于20oC10mg/ml鮭魚精DNA：超聲法或用注射器經(jīng)過6號針頭反復抽打?qū)NA打斷。煮沸后置20oC保管，運用前置沸水浴中煮沸5分鐘后速置冰浴中。甲酰胺：運用前用Dowe

23、x XG8混合床陰陽離子交換樹脂處置1小時，小量分裝后置70oC保管。膜的處置：將結(jié)合了DNA(或RNA)的硝酸纖維素膜或尼龍膜浸泡于6SSC溶液中2分鐘，使其充分潮濕。預雜交：將潮濕的濾膜放入一塑料袋中，按每平方厘米膜0.2ml量參與預雜交液，盡量排除其中的氣泡后用封口機封口。溫育：將雜交袋浸入適當溫度的恒溫水浴中(不加甲酰胺時用68oC；參與50甲酰胺時，恒溫42oC)，溫育12小時，也可延伸至1216小時。保溫過程中應(yīng)不斷搖動塑料袋，以趕走蓋在濾膜外表的氣泡，否那么這些氣泡將妨礙雜交液與濾膜的接觸。(假設(shè)將預雜交液加熱到適當溫度后再參與塑料袋內(nèi)，可以減少氣泡產(chǎn)生)。2、雜交：雜交反響是單

24、鏈核酸探針與待測核酸分子中的特異基因序列在一定的溫度下雜交復性的過程。雜交包括以下過程：1、雜交液配制：同預雜交液2、探針變性：放射性標志的探針為雙鏈時，于100oC加熱5分鐘變性并迅速在冰水浴中將探針驟冷。單鏈探針無須變性3、翻開預雜交袋棄去預雜交液，參與雜交液及變性的探針。排除氣泡后重新封好口4、在與預雜交一樣溫度下，保溫816小時洗膜：是將濾膜上未與DNA雜交的及非特異性雜交的探針分子從濾膜上洗去的過程，非特異性雜交體穩(wěn)定性較低，解鏈溫度較低，在一定溫度下，非特異性雜交體解鏈而被洗掉，而特異性雜交體那么保管在濾膜上。雜交體的解鏈溫度主要取決于雜交體的同源性和溶液的離子強度兩個要素，同源性越高離子強度越高，雜交體的穩(wěn)定性越高。洗膜的操作如下：1、雜交終了，取出雜交袋，剪去一角，棄去一切的雜交液，取出膜并迅速浸泡于大量2SSC和0.5% SDS溶液中，室溫下不斷振蕩。留意不要使濾膜枯燥。2、5分鐘后，將濾膜轉(zhuǎn)移至一盛有大量2SSC和0.1% SDS溶液的容器中，室溫振蕩15分鐘