PCR發(fā)展歷程綜述

1、PCR技術(shù)發(fā)展歷程綜述摘要：PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶鏈式反應，是指在DNA聚合酶催化下。以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點。通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。本文簡要敘述了PCR技術(shù)的發(fā)展歷程及現(xiàn)在所發(fā)展起來的相關(guān)技術(shù)。關(guān)鍵詞：PCR技術(shù) 變性 退火 延伸1.PCR技術(shù)的發(fā)展簡史1971年Khorana等最早提出PCR理論：“DNA變性解鏈后與相應引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，重復該過程便可克隆tRNA基因”。因當時基因序列分析方法尚未成熟、熱穩(wěn)定DNA聚合酶還未發(fā)現(xiàn)及寡聚核苷酸引物合成仍處于手工

2、和半自動階段，核酸體外擴增設(shè)想似乎不切實際，且Smith等已發(fā)現(xiàn)了DNA限制性內(nèi)切酶，使體外克隆基因成為可能，Khorana等的早期設(shè)想被忽視。1985年Mullis等用大腸桿菌DNA聚合酶工Klenow片段體外擴增哺乳動物單拷貝基因成功，1985年10月25日申請了PCR的專利，1987年7月28日批準（專利號4,683,202 ），Mullis是第一發(fā)明人；1985年12月20日在Science雜志上發(fā)表了第一篇PCR的學術(shù)論文，Mullis是共同作者。但當時Mullis所使用的大腸桿菌聚合酶1的片段Klenow存在一些缺陷：Klenow酶不耐熱，在對DNA模板進行熱變性時，會導致此酶的鈍

3、化，因此需要每完成一個擴增周期增加一次酶。1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶進行PCR，提高擴增DNA片段的均一性，1988年Saiki等從溫泉中分離的一種水生嗜熱桿菌中提取到一種耐熱DNA聚合酶，使擴增反應的特異性和效率大大提高，并簡化了操作程序，最終實現(xiàn)了DNA擴增的自動化，迅速推動了PCR的應用和普及。現(xiàn)已被廣泛應用于農(nóng)學、植物病理學、生物學等領(lǐng)域的研究。最初的PCR技術(shù)相當不成熟,但在隨后的幾十年里，PCR技術(shù)被不斷改進，它從一種定性的分析方法發(fā)展到定量測定；從原先只能擴增幾個kb的基因到目前已能擴增長達幾十個kb的DNA片斷。短短幾十年，該技術(shù)已經(jīng)成為最常用也最重要的

4、分子生物學技術(shù)之一，其應用范圍從基本的基因擴增，擴展到基因克隆、基因改造、傳染病源分析、遺傳指紋鑒定等，甚至擴展到許多非生物領(lǐng)域。2.PCR技術(shù)的原理PCR 技術(shù)是根據(jù)待擴增的已知 DNA 片段序列，人工合成與該 DNA 2 條鏈末端互補的 2 段寡核苷酸引物，在體外將待檢 DNA 序列（模板）在酶促作用下進行擴增。PCR 的整個技術(shù)過程經(jīng)若干個循環(huán)組成，一個循環(huán)包括連續(xù)的 3 個步驟：第 1 步是高溫條件下的 DNA 模板變性，即模板 DNA在 9394 的條件下變性解鏈；第 2 步是退火，即人工合成的 2 個寡核苷酸引物與模板 DNA 鏈 3端經(jīng)降溫至 55 退火；第 3 步是延伸，即在

5、4 種 dNTP 底物同時存在的情況下，借助 TaqDNA 聚合酶的作用，引物鏈將沿著 5-3方向延伸與模板互補的新鏈。經(jīng)過這個循環(huán)后，合成了新鏈，可將其作為 DNA 模板繼續(xù)反應，由此循環(huán)進行。循環(huán)進程中，擴增產(chǎn)物的量以指數(shù)級方式增加，一般單一拷貝的基因循環(huán) 2530 次，DNA 可擴增 l00 萬200 萬倍。PCR 反應的步驟很簡單，但是具體的操作是復雜的，如退火溫度的確定、延伸時間的長短以及循環(huán)數(shù)等。因此，不同的反應體系應該確定適當?shù)姆磻獥l件，以避免假陰性或假陽性等情況的產(chǎn)生。3.PCR技術(shù)進步關(guān)鍵3.1熱循環(huán)儀市場上有眾多的產(chǎn)品, 在質(zhì)量和技術(shù)上首推 PE及MJ reasearch。

6、總的發(fā)展趨勢是 1) 無油操作, 要求的反應體積小, PE 2400 可做小至 5uL 的反應; 2) 升降溫速度快, PE9700 可達到 3.5/ s, 溫控精度及靜態(tài)樣品溫度均衡性高, 這一點是通過控制反應管內(nèi)的溫度, 而非加熱塊的溫度來實現(xiàn)的; 3) 界面友好,操作靈活, 顯示直觀, 允許多用戶。此外, 還有幾種特殊用途的 PCR 儀: 大容量 PCR 儀, The Tetrad( MJResearch) 可同時做 1536 個反應, 適合于高通量實驗室的要求; 實時定量 PCR, ABI PRISMTM5700( PE) 能對PCR 過程做到實時定量監(jiān)控, 閉管操作, 無污染, 無須

7、擴增后處理; 梯度 PCR 儀, 例如, Eppendorf 的產(chǎn)品, 可在一個反應槽內(nèi), 一次實驗當中快速地測定最佳變性溫度和退火溫度, 節(jié)省時間, 減輕實驗強度;PCR 儀的加熱部分和控制部分分離, Remote Alpha DockTMSystem( RAD MJ Research) 的這兩部分可以分開遠達 3m 節(jié)省實驗室空間, 便于進行自動化操作。同時有多種形式的加熱部分可供選擇, 可以滿足不同的要求。3.2引物設(shè)計與合成引物的設(shè)計可通過計算機和網(wǎng)絡(luò)來實現(xiàn)。網(wǎng)上有許多提供免費在線引物設(shè)計服務的網(wǎng)址和軟件，例如在線版的Primer3.0，以及Primer5.0等軟件，設(shè)計好的引物則完全

8、由專業(yè)公司來合成, 合成的引物一般進行 PAGE 純化,而且可以根據(jù)實驗的要求對引物采取不同的修飾處理。3.3DNA聚合酶系已經(jīng)發(fā)展出了多種具有各種不同特性的聚合酶和酶反應體系( 表 1) 。結(jié)合優(yōu)化的緩沖液條件,DNA 聚合酶已具有更高的特異性,敏感性,可以擴增出更長的產(chǎn)物,并且可成功地用于富含 GC 的模板的擴增。目前已開發(fā)出了一系列可滿足不同需求的DNA 聚合酶試劑盒,簡化了 PCR 操作,提高了實驗的重現(xiàn)性。4.PCR相關(guān)技術(shù)4.1常規(guī)RT-PCR技術(shù)由于目前常利用cDNA來研究基因的功能,而cDNA是由mRNA反轉(zhuǎn)錄而成。所以采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(reverse transcri

9、ption-polymerase chain reaction, RT-PCR)可擴增大量cDNA。主要包括兩個步驟,一個是反轉(zhuǎn)錄,另一個就是PCR,首先提取RNA并純化,以其中的mRNA作為模板,采用Oligo(dT)或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈。然后以第一鏈cDNA為模板進行PCR擴增,而獲得目的基因或檢測基因表達。反應過程的第一步是從細胞中提RNA,并分離出 mRNA。第二步以mRNA為模板,在反轉(zhuǎn)錄酶的催化下合成cDNA。第三步以cDNA為模板,用PCR對靶序列進行擴增。最后用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。該技術(shù)主要用于分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA

10、探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。4.2多重 PCR（mutiplex PCR）技術(shù) PCR 技術(shù)的一種，為同一管中加入多對特異性引物，與 PCR 管內(nèi)的多個模板反應，在一個 PCR 管中同時檢測多個目標 DNA 分子。多重 PCR技術(shù)可以擴增一個物種的一個片段，也可以同時擴增多個物種的不同片段。在同一反應體系中，多重 PCR 技術(shù)進行多個位點的特異性擴增時，引物間的配對、引物間的競爭性擴增等會對擴增效果產(chǎn)生重要影響。一方面，如果能選擇適宜的反應體系和反應條件，可極大地提高多重 PCR 的擴增效果。主要包括退火溫度、退火及延伸時間、PCR 緩沖液成分、dNTP 的用量、引物及模板的量等。另一方面，

11、DNA 的抽提質(zhì)量也影響多重 PCR 擴增效率，如 DNA 抽提不干凈或降解都將影響PCR 擴增效果。4.3反向PCR技術(shù)反向PCR(reverse PCR)，又稱為染色體緩移(chrornosme walking)，它是指利用在已知序列內(nèi)部沒有切點的限制性內(nèi)切酶對此段DNA進行酶切，在DNA連接酶作用下自連形成環(huán)狀DNA分子，然后利用方向合適并與已知序列兩端互補的引物，以連接成環(huán)的DNA為模板，經(jīng)PCR擴增得到已知序列的旁側(cè)DNA片段。與常規(guī)PCR技術(shù)相比。反向PCR優(yōu)勢突出，但它需要從許多酶中選擇限制酶?；蛘哒f必須選擇一種合適的酶進行酶切。另外，由于大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復序

12、列，在YAC或Cosmid的未知功能序列中有時也會存在這些序列。從而導致反向PCR得到的探針與多個基因序列雜交，影響擴增效果。4.4巢式PCR(嵌套PCR)技術(shù)這是一種對PCR的優(yōu)化模式,不受平臺效應的限制,而且比單一的一對引物PCR擴增靈敏度特異性高1000倍。由兩輪PCR擴增和利用兩對引物組成,其中第二對引物是在第一對引物的內(nèi)部,第一輪PCR的產(chǎn)物作為第二輪PCR的模板,增強了產(chǎn)物的特異性。反應過程的第一步是引物的設(shè)計,原則與常規(guī)PCR相同,只不過是設(shè)計兩對嵌套式引物。第二步所用的模板通常都是反轉(zhuǎn)錄而來的cDNA,經(jīng)過兩次PCR。第三步檢測PCR反應產(chǎn)物。此反應大多應用在當模板DNA較少時

13、,用一次PCR難以得到滿意的結(jié)果,用巢式PCR能得到很好的效果。4.5實時熒光定量 PCR 技術(shù)1996 年，學者經(jīng)過研究，在傳統(tǒng) PCR 技術(shù)的基礎(chǔ)上，首創(chuàng)了實時熒光定量 PCR 技術(shù)，新技術(shù)已經(jīng)應用至醫(yī)學領(lǐng)域、分子生物學和其他基礎(chǔ)研究領(lǐng)域。實時熒光定量 PCR 技術(shù)基于傳統(tǒng)技術(shù)的優(yōu)勢，還具有實時性、準確性、無污染，實現(xiàn)了自動化操作和多重反應，是 PCR 技術(shù)研究史上從定性到定量的飛躍。熒光定量 PCR 技術(shù)最大的特點是能將熒光基團加入到PCR 反應體系中，借助于熒光信號，累積實時監(jiān)測整個 PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。實時監(jiān)測這一特點是常規(guī) PCR 技術(shù)所不具有的，因

14、為其對擴增反應不能進行隨時的檢測。常規(guī) PCR 技術(shù)的擴增終產(chǎn)物需要在凝膠電泳等條件下才能進行，無法對起始模板進行準確的定量，而熒光定量 PCR 技術(shù)的反應進程可以根據(jù)熒光信號的變化做出準確的判斷。一個 PCR 循環(huán)反應結(jié)束之后，定量 PCR 儀可以收集 1 個熒光強度信號，熒光信號強度的變化可以反映產(chǎn)物量的變化情況，這樣就可以得到 1 條熒光擴增曲線。熒光信號在指數(shù)擴增階段 ，PCR 產(chǎn)物熒光信號的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性對應關(guān)系，然后進行定量分析。另外還有多種PCR相關(guān)的技術(shù),如不對稱PCR,MSP甲基化特異PCR,免疫PCR,錨定PCR,PACE-cDNA末端的快速擴增可根據(jù)研究目

15、的不同作相應的選擇。5.展望PCR作為一項“革命性的技術(shù)”，不僅推動了遺傳與分子生物學的發(fā)展而且，在其它領(lǐng)域科學家的努力與創(chuàng)新下。其不斷與該領(lǐng)域的核心技術(shù)相結(jié)合，極大地推動了此領(lǐng)域的發(fā)展。傳統(tǒng) PCR 技術(shù)以及衍生出來的新型 PCR 技術(shù)自面世以來，已被廣泛應用到生命科學的各個領(lǐng)域。隨著技術(shù)方法的不斷改進與完善，熒光定量 PCR 技術(shù)將會逐漸完善并廣泛應用。多重 PCR 技術(shù)在食品病原微生物、非致病微生物及環(huán)微生物檢測中具有重要作用；未來的研究主要集中在去除食品抑制因子干擾、改進樣品前處理技術(shù)等方面，總之，隨著科學技術(shù)的不斷進步PCR技術(shù)必將得到新的發(fā)展，以之為基礎(chǔ)的新技術(shù)將不斷出現(xiàn)。參考文獻

16、1.曹雪燕，張曉東，等.聚合酶鏈式反應（PCR）研究新進展.自然科學進展.2007.17(5).2.陶生策，張治平，張先恩.PCR技術(shù)研究進展.生物工程進展.2001.21(4)3.黃留玉PCR最新技術(shù)原理、方法及應用M北京：化學工業(yè)出版社20054.孟祥文，李璞AP-PCR技術(shù)及其應用J國外醫(yī)學遺傳學分冊199518(3)：117-1205.陳尚武不同種類的PCR技術(shù)及其應用J貴陽醫(yī)學院校報199314(3)：113-l166.金宇良.PCR技術(shù)的研究進展.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技.2012.107.常世敏.PCR 在食品微生物檢測中的應用J.邯鄲農(nóng)業(yè)高等專科學校學報，2004，21（4）：23-25.

17、8.葉倩.PCR技術(shù)綜述.科技創(chuàng)新導報.2009.59.唐永凱，俞菊華，徐跑，等.實時熒光定量 PCR 技術(shù)及其在水產(chǎn)上的應用J.中國農(nóng)學通報，2010（21）：422-426.10.吳學貴.LPS 刺激點帶石斑魚免疫相關(guān)基因的克隆與組織表達差異性分析D.海口：海南大學，2011.11.侯立華，黃新，朱水芳，等.雙色熒光多重 PCR 技術(shù)及在禽流感病毒檢測中的應用J.生物技術(shù)通報，2010（1）：168-172.12.張杰道.生物化學實驗技術(shù) PCR 技術(shù)及應用M.北京：科學出版社 ，2005：12-18.13.邵軍軍?；菔|，謝慶閣原位PCR技術(shù)及其應用J中國獸醫(yī)科學與技術(shù)200333(6)：

18、323514.謝輝章偉文陳宏。等原位反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)及其應用的研究進展J醫(yī)學理論與實踐，2003。16(4)：40240315.彭年才牽明苗寶刖用于食品微生物快速檢測的實時定量PCR儀及ATP儀的研制和應用20l0年第三屆國際食品安全高峰論壇鹼立集2010：20-2216.趙敏多基因PCR及其應用J國外醫(yī)學流行病學傳染宿學分冊199522(6)：270-27217.高玉龍焦芳嬋徐照麗等多重PCR在煙草轉(zhuǎn)基因檢測中的應用J生物技術(shù)通報，2008(2)：140-14218.李竹紅，劉德培梁植權(quán)改進的反向PCR技術(shù)克隆轉(zhuǎn)移基因的旁側(cè)序列J生物化學與生物物理進展 1999。26(6)：6019.陳柏君孫超王勇等錨定PCR(Anchored PCR)：一種新的染色體步行方法J科學通報200449(15)：1569-157120.賈小平，王天字黎裕等用錨定PCR技術(shù)篩選谷子微衛(wèi)星文庫的研究J吉林農(nóng)業(yè)大學學報2009.3l(4)：364367，37221.Chen RH.Fuggle SVIn situ cDNA polymerase chain reaction：rescearch and clinicalAIn：Kirkam N.Programe in PathologyVal 2CLondon UK：Churchill