WB原理及操作注意事項(xiàng)詳解

1、WB原理及操作注意事項(xiàng) 印跡法(bloting)是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來檢測(cè)樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC）上，并利用DNA-RNA雜交檢測(cè)特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對(duì)RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對(duì)RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對(duì)單向電泳后的蛋白質(zhì)印跡分析稱為Western印跡法（Western bloting），對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。原理 免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質(zhì)印跡(Western blo

2、tting)，是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測(cè)復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測(cè)定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。由于免疫印跡具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測(cè)定高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白質(zhì)分析的一種常規(guī)技術(shù)。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對(duì)某種蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。特點(diǎn) 1.SDS-PAGE的高分辨力 2.固相免疫測(cè)定高特異性和敏感性常見問題和注意事項(xiàng) 一.蛋白處理與樣品處理 二.蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印 三.免疫雜交 四.信號(hào)檢測(cè)一、蛋白處理與樣品處理 1.如何選擇裂解液？ 2.目標(biāo)蛋白含量低怎么辦？1.如何選擇裂解液 變性裂解液：快速，含有離子型去垢劑，

3、作用強(qiáng)，可迅速從組織和細(xì)胞中提取大量蛋白質(zhì) eg：2*SDS上樣緩沖液 非變性裂解液：較溫和，適用于識(shí)別非變性的抗原表位的抗體，可配合免疫沉淀、活性分析等應(yīng)用 eg：RIPA buffer（含TritonX-100，提全細(xì)胞蛋白） Total protein Extraction Kit (含NP-40，更溫和) Whole Cell Extraction Kit(最溫和，可做酶活性分析) Nuclear Extraction Kit(用來提取核蛋白)2.目標(biāo)蛋白表達(dá)量低 加大上樣體積 濃縮樣品 超濾離心，快速、高效，且可以起到一定的提純效果，去除一些小分子蛋白 增大膠厚度 二、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印 1.轉(zhuǎn)印不完全 2.小分子蛋白的穿流 3.免疫檢測(cè)前如何判斷轉(zhuǎn)移效果 4.操作規(guī)范1.轉(zhuǎn)印不完全要選對(duì)膜！常用的膜有兩種：PVDF：聚偏二氟乙烯NC： 硝酸纖維素優(yōu)化轉(zhuǎn)移過程 調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移緩沖液成分： SDS（1min The high affinity of PVDF for protein gives efficient transfer and high detection efficiency, but it can make background control more difficult.