發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基及原料處理

1、第三章 發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基 及原料處理 發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基是工業(yè)發(fā)酵微生物生長和分泌發(fā)酵產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)。發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基的設(shè)計、原料處理和配制是發(fā)酵工程的重要操作單元之一。本章主要內(nèi)容 第一節(jié) 發(fā)酵營養(yǎng)基質(zhì)的組成 第二節(jié) 工業(yè)發(fā)酵中營養(yǎng)基質(zhì)的種類 第三節(jié) 培養(yǎng)基的確定和優(yōu)化 第四節(jié) 原料的選擇及工業(yè)發(fā)酵中 重要營養(yǎng)基質(zhì)的配制方法本章主要內(nèi)容 第一節(jié)第一節(jié) 發(fā)酵營養(yǎng)基質(zhì)的組成發(fā)酵營養(yǎng)基質(zhì)的組成 第二節(jié) 工業(yè)發(fā)酵中營養(yǎng)基質(zhì)的種類 第三節(jié) 培養(yǎng)基的確定和優(yōu)化 第四節(jié) 原料的選擇及工業(yè)發(fā)酵中 重要營養(yǎng)基質(zhì)的配制方法第一節(jié) 發(fā)酵營養(yǎng)基質(zhì)的選擇 培養(yǎng)基是指利用人工方法配制的供微生物、植物和動物細(xì)胞生長繁殖或積累代謝

2、產(chǎn)物的各種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。主要用于微生物等的分離、培養(yǎng)、鑒定以及菌種保藏等方面。工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基除了包含微生物生長繁殖所必須的碳源、氮源、能源、無機(jī)鹽、生長因子和水等營養(yǎng)成分，有的還含有某些前體、產(chǎn)物促進(jìn)劑和抑制劑等。一、能源 功能：功能：微生物生長、繁殖、合成、分解、運(yùn)動、熱的產(chǎn)生等，即微生物的一切行為都需要消耗能源。光能-光能自養(yǎng)菌的能源。如：小球藻、螺旋藻利用光能生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白；嗜鹽藻利用光能生產(chǎn)甘油、-胡羅卜素和單細(xì)胞蛋白等。氫、硫、氨、亞硝酸鹽、亞鐵鹽-化能自養(yǎng)微生物的能源。如：細(xì)菌煉銅所使用的氧化亞鐵硫桿菌，將亞鐵鹽作為能源。碳水化合物等有機(jī)物，石油天然氣和石油化工產(chǎn)品-異養(yǎng)微生物

3、能源，同時也是碳源物質(zhì)。New Biofuel technology using sunlight and micro-organisms could change the industry 二、碳源 功能：功能：碳源物質(zhì)是組成培養(yǎng)基的主要成分之一，因?yàn)樘荚次镔|(zhì)在微生物細(xì)胞中的含量很高。占細(xì)胞干物質(zhì)50%。 碳源物質(zhì)為細(xì)胞提供能量 、組成菌體細(xì)胞成分的碳架、構(gòu)成代謝產(chǎn)物。 常用的碳源物質(zhì)包括糖類、脂類、有機(jī)酸、低碳醇。 葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、糊精、淀粉等糖類物質(zhì)，是細(xì)菌、放線菌、霉菌、酵母利用的碳源。其中，葡萄糖是碳源中最容易利用的單糖，幾乎所有微生物都能利用葡萄糖。（葡糖效應(yīng)和中期溶氧

4、不足）其他糖類：蔗糖、麥芽糖、乳糖等雙糖也是常用的碳源。多糖如淀粉和纖維素。淀粉還可以克服葡萄糖代謝過快的弊病，并且價格低廉，來源豐富。蔗糖、麥芽糖、乳糖等雙糖常用于抗生素、氨基酸、酶類的發(fā)酵。酯類：如植物油，動物油等脂類，具備較活躍的脂肪酶的微生物可利用脂類為碳源，但是耗氧量會增加，因此要提供更多的氧。有機(jī)酸：有機(jī)酸或他們的鹽類或醇類能做為碳源。pH會有變化。烴類：碳酸氣、石油、正構(gòu)石蠟、天然氣、甲醇、乙醇等石油化工產(chǎn)品，也是許多微生物碳源。如：嗜甲烷棒狀桿菌利用甲醇為碳源產(chǎn)生單細(xì)胞蛋白；乳糖發(fā)酵短桿菌，以乙醇為碳源生產(chǎn)谷氨酸。糖蜜淀粉三、氮源 功能：功能：氮源物質(zhì)構(gòu)成菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)（氨基

5、酸、蛋白質(zhì)、核酸）；為微生物提供能源；合成含氮的代謝產(chǎn)物。 常用的氮源分為兩類：無機(jī)氮源和有機(jī)氮源。1. 無機(jī)氮源主要包括氨水、銨鹽、硝酸鹽、亞硝酸鹽等。其被利用速度及吸收速度均快于有機(jī)氮源，也被稱為速效氮源。一般情況下作為輔佐氮源。生理酸性氮源和生理堿性氮源常被用來做發(fā)酵過程中培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)的一種有效手段。2. 有機(jī)氮源 主要成分復(fù)雜的工農(nóng)業(yè)下腳料，包括豆粉、玉米粉、豆餅、魚粉、蠶蛹粉、釀酒工業(yè)的酒糟等。 米粉、豆餅、魚粉、蠶蛹粉、釀酒工業(yè)的酒糟等。 玉米漿：一般含10%左右的乳酸，pH值在4左右，一般用于抗生素發(fā)酵。尿素（脲） ：抗生素和氨基酸發(fā)酵，尤其是谷氨酸的生產(chǎn)。能分泌脲酶的微生物才

6、能利用。氮含量高達(dá)50%，但是營養(yǎng)成分單一。蛋白胨（動物組織和植物水解制備）：實(shí)驗(yàn)室用有機(jī)氮源魚粉酒糟四、無機(jī)鹽及微量元素 功能：功能：構(gòu)成菌體的成分；酶的組成部分或其激活劑、抑制劑；調(diào)節(jié)滲透壓、菌體內(nèi)部pH以及氧化還原電位等等。 大量元素（0.11mM），包括P、S、K、Mg 、Ca、Na、Fe，常常以鹽的形式加入培養(yǎng)基。如：磷酸鹽，鉀鹽，鎂鹽，鈣鹽等。 微量元素（0.01 1mM），包括Cu、Zn、Mn、Mo和Co等，Co是發(fā)酵微生物 B12 的激活劑。 K,Na,Ca等離子雖然不是細(xì)胞的組成成分，但是與維持細(xì)胞的一定滲透壓和細(xì)胞透性相關(guān)，并且是許多酶得得激活劑。 五、生長因子 功能：功能

7、：生長因子為微生物必不可少的物質(zhì)，一般為小分子有機(jī)物，需求量很小。 包括：維生素、堿基等。維生素中需求量最大的為B族維生素，多為生化代謝中的輔酶。 一般不需要單獨(dú)添加。天然原料（玉米漿、糖蜜、豆餅水）及實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基（酵母膏）等都已經(jīng)含有。 應(yīng)用實(shí)例：生物素合成生物質(zhì)膜的重要輔酶，不足會造成細(xì)胞膜不完整，細(xì)胞內(nèi)容物的滲漏。添加亞適量（5mg/L），可即使菌體生長少受抑制也可以使過多的谷氨酸因外泄而源源不斷地合成。六、前體物質(zhì) 前體物質(zhì)指添加到培養(yǎng)基中的物質(zhì)，并不促進(jìn)微生物生長，而是直接經(jīng)微生物的生物合成過程結(jié)合到產(chǎn)物分子上去，其自身結(jié)構(gòu)基本不變，而產(chǎn)物產(chǎn)量卻因此提高。 可看作是一種底物。 過量則

8、對菌體有毒！方式：流加。 例子：最早在青霉素發(fā)酵中發(fā)現(xiàn)前體物質(zhì)。發(fā)現(xiàn)添加玉米漿可提高青霉素G的含量，深入研究發(fā)現(xiàn)玉米漿含有苯乙酸，苯乙酸是青霉素G的側(cè)鏈，即苯乙酸是青霉素G發(fā)酵的前體物質(zhì)。不同青霉素的側(cè)鏈不同：青霉素V- -苯氧乙酸 鏈霉素- -肌醇、甲硫氨酸、精氨酸 紅霉素- -丙酸、丙醇、丙酸鹽、乙酸鹽 七、促進(jìn)劑和抑制劑1、促進(jìn)劑：并不是前體或營養(yǎng)物質(zhì)，但卻能提高產(chǎn)量的物質(zhì)。 作用方式： 或影響微生物正常代謝；或促進(jìn)中間產(chǎn)物的累積；或提高次級代謝產(chǎn)物量。 如：巴比妥鹽能增加生產(chǎn)菌菌絲的抗自溶能力，達(dá)到推遲菌體自溶目的，增加鏈霉素和利福霉素等抗生素的累積。 如：谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)賴氨酸的時

9、候，加入紅霉素可以提高產(chǎn)量25%以上，加入表面活性劑可以增加產(chǎn)量30%以上。 2、抑制劑：一些對生產(chǎn)菌代謝途徑有某種調(diào)節(jié)能力的物質(zhì)。 抑制某些代謝途徑的進(jìn)行，同時刺激另 一個代謝途徑，之一改變代謝途徑，如：酵母厭氧發(fā)酵中加入亞硫酸鹽或堿類，可以促 進(jìn)酒精發(fā)酵轉(zhuǎn)入甘油發(fā)酵。 淘汰雜菌的抑制劑，如：真菌發(fā)酵中加入抗生素； 帶抗生素抗性的工程菌發(fā)酵中加入該抗生素， 淘汰非重組細(xì)胞或突變細(xì)胞。 八、水（1） 水是良好的溶劑，菌體所需要的營養(yǎng)物質(zhì)都是溶解于水中被吸收的。（2） 滲透、分泌、排泄等作用都是以水為媒介的；（3） 水直接參與代謝作用中的許多反應(yīng)。所以，水在生物化學(xué)反應(yīng)中占有極為重要的地位。（4

10、） 水的比熱高，能有效地吸收代謝過程中所放出的熱，使細(xì)胞內(nèi)溫度不致驟然上升。（5） 水是熱的良導(dǎo)體，有利于放熱，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的溫度。本章主要內(nèi)容 第一節(jié) 發(fā)酵營養(yǎng)基質(zhì)的組成 第二節(jié)第二節(jié) 工業(yè)發(fā)酵中營養(yǎng)基質(zhì)的種類工業(yè)發(fā)酵中營養(yǎng)基質(zhì)的種類 第三節(jié) 培養(yǎng)基的確定和優(yōu)化 第四節(jié) 原料的選擇及工業(yè)發(fā)酵中 重要營養(yǎng)基質(zhì)的配制方法第二節(jié) 工業(yè)發(fā)酵中營養(yǎng)基質(zhì)的種類 一、 天然、合成、半合成培養(yǎng)基1、天然培養(yǎng)基（undefined medium）：是采用化學(xué)成分還不清楚或化學(xué)成分還不恒定的各種植物和動物組織或微生物的浸出物、水解液等物質(zhì) (例如牛肉膏、酵母膏、麥芽汁、蛋白胨、玉米漿、各種淀粉水解液、糖蜜等)制成

11、的。 優(yōu)點(diǎn)：取材方便、營養(yǎng)豐富、價格低廉、適用范圍廣； 缺點(diǎn)：原料質(zhì)量不穩(wěn)定，不利于發(fā)酵控制。2、合成培養(yǎng)基（defined medium）：是用化學(xué)成分和數(shù)量完全了解的物質(zhì)配制而成的，成分精確，重復(fù)性強(qiáng)，可以減少不能控制的因素。 適用于在實(shí)驗(yàn)室范圍作有關(guān)營養(yǎng)、代謝、分類鑒定、生物測定及選育菌種、遺傳分析等定量研究工作。 缺點(diǎn)：營養(yǎng)單一，價格高，適用范圍較窄。 3、半合成培養(yǎng)基（semi-defined medium）：既有天然有機(jī)物作碳源、氮源和生長因子的來源，又含有一些化學(xué)藥品以補(bǔ)充無機(jī)鹽成分，使其更能充分滿足微生物對營養(yǎng)的需要。 大多數(shù)微生物都能在此培養(yǎng)基上生長繁殖。因此，在微生物 工業(yè)

12、生產(chǎn)上和試驗(yàn)研究中被廣泛使用。二、固體、液體、半固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基（liquid medium）：常用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)及生理代謝等基本理論研究工作。發(fā)酵工業(yè)多用作培養(yǎng)種子和發(fā)酵的培養(yǎng)基。根據(jù)微生物對氧的要求情況，分別作根據(jù)微生物對氧的要求情況，分別作靜止或通風(fēng)攪拌培養(yǎng)。在菌種篩選工作和菌種擴(kuò)大培養(yǎng)工作中，也常用液體培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)。固體培養(yǎng)基（solid medium）：是在 液體培養(yǎng)基中加入凝固劑配成的，最 常用的凝固劑是瓊脂。 分類：斜面試管、平板等。 功能：在菌種的分離、保藏、 菌落特征的觀察、活菌計數(shù) 和鑒定菌種方面是不可缺少。半固體培養(yǎng)基（semi-solid medium）：

13、 0.5%瓊脂。主要用于實(shí)驗(yàn)室的微生物運(yùn)動觀察（穿刺培養(yǎng)），某些厭氧菌的保藏工作。三、鑒別和選擇性培養(yǎng)基 鑒別培養(yǎng)基（differential medium）：是根據(jù)微生物能否利用培養(yǎng)基中某種營養(yǎng)成分，借助指示劑的顯色反應(yīng)，以鑒別不同種類的微生物。 選擇培養(yǎng)基（selective medium）：根據(jù)某種微生物的特殊營養(yǎng)要求或其對某種物理化學(xué)因素的抗性而設(shè)計的培養(yǎng)基，目的是使混合樣品中的劣勢菌群變成優(yōu)勢菌群，或同時還會加入一些特殊的抑制劑來抑制競爭菌群。藍(lán)白篩選平板多種腸道菌群用EMB培養(yǎng)基來鑒別四、發(fā)酵生產(chǎn)的培養(yǎng)基種子、孢子、發(fā)酵培養(yǎng)基孢子培養(yǎng)基：供菌種繁殖孢子，常采用固體培養(yǎng)基，目的是在使

14、發(fā)酵菌種不發(fā)生變異的前體下盡可能多的產(chǎn)生孢子?；疽笫窃跔I養(yǎng)基本保證、理化條件適宜的前提下，營養(yǎng)不要太豐富（特別是有機(jī)氮源），否則不易產(chǎn)孢子。生產(chǎn)商常用的：麩皮培養(yǎng)基、小米培養(yǎng)基、大米培養(yǎng)基、玉米培養(yǎng)基等。 種子培養(yǎng)基：供孢子發(fā)芽生長出大量的菌絲體，或不產(chǎn)生孢子放入菌種繁殖出大量的細(xì)胞，并具有較高的活力和純度的培養(yǎng)基。 特點(diǎn)： 1. 必須有較完全和豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，特別需要充足的氮源和生長因子； 2.供孢子發(fā)芽生長用的種子培養(yǎng)基，可添加一些易被吸收利用的碳源和氮源； 3.種子培養(yǎng)基成分還應(yīng)考慮與發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分相近，使種子盡快適應(yīng)發(fā)酵培養(yǎng)基，縮短周期。 發(fā)酵培養(yǎng)基：供菌種生長繁殖和合成發(fā)酵

15、產(chǎn)物的培養(yǎng)基。 是發(fā)酵生產(chǎn)中最主要的培養(yǎng)基，它不僅耗用大量的原材料，而且也是決定發(fā)酵生產(chǎn)成功與否的重要因素。 （1）根據(jù)產(chǎn)物合成的特點(diǎn)來設(shè)計培養(yǎng)基。 對菌體生長與產(chǎn)物相偶聯(lián)的發(fā)酵類型，充分滿足細(xì)胞生長繁殖的培養(yǎng)基就能獲得最大的產(chǎn)物。 對于生產(chǎn)氨基酸等含氮的化合物時，它的發(fā)酵培養(yǎng)基除供給充足的碳源物質(zhì)外，還應(yīng)該添加足夠的銨鹽或尿素等氮素化合物。 （2）發(fā)酵培養(yǎng)基的各種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度應(yīng)盡可能高些，這樣在同等或相近的轉(zhuǎn)化率條件下有利于提高單位容積發(fā)酵罐的利用率，增加經(jīng)濟(jì)效益。 （3）發(fā)酵培養(yǎng)基需耗用大量原料，因此，原料來源、原材料的質(zhì)量以及價格等必須予以重視。 本章主要內(nèi)容 第一節(jié) 發(fā)酵營養(yǎng)基質(zhì)的組

16、成 第二節(jié) 工業(yè)發(fā)酵中營養(yǎng)基質(zhì)的種類 第三節(jié)第三節(jié) 培養(yǎng)基的確定和優(yōu)化培養(yǎng)基的確定和優(yōu)化 第四節(jié) 原料的選擇及工業(yè)發(fā)酵中 重要營養(yǎng)基質(zhì)的配制方法第三節(jié) 培養(yǎng)基的選擇和優(yōu)化一、培養(yǎng)基的選擇（1）首先必須做好調(diào)查研究工作，了解菌種的來源、生活習(xí)慣、生理生化特性和一般的營養(yǎng)要求（見表 四大類微生物的典型培養(yǎng)基）。 工業(yè)生產(chǎn)主要應(yīng)用細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌四大類微生物。 它們對營養(yǎng)的要求既有共性，也有各自的特性，應(yīng)根據(jù)不同類型微生物的生理特性考慮培養(yǎng)基的組成。（2）其次，對生產(chǎn)菌種的培養(yǎng)條件，生物合成的代謝途徑，代謝產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)、一般提煉方法和產(chǎn)品質(zhì)量要求等也需要有所了解，以便在選擇培養(yǎng)

17、基時做到心中有數(shù)。（3）最好先選擇一種較好的化學(xué)合成培養(yǎng)基做基礎(chǔ)，開始時先做一些搖瓶試驗(yàn)； 然后進(jìn)一步做小型發(fā)酵罐培養(yǎng)，摸索菌種對各種主要有機(jī)碳源和氮源的利用情況和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的能力。 注意培養(yǎng)過程中的pH變化，觀察適合于菌種生長繁殖和適合于代謝產(chǎn)物形成的兩種不同pH，不斷調(diào)整配比來適應(yīng)上述各種情況。二、工業(yè)發(fā)酵營養(yǎng)基質(zhì)的選擇 完善的培養(yǎng)基設(shè)計實(shí)驗(yàn)室的試驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)工廠和生產(chǎn)規(guī)模的放大中的一個重要步驟。培養(yǎng)基是否適合于菌體的生長或累積代謝產(chǎn)物，對終產(chǎn)品得率的影響非常大。表 細(xì)菌、酵母和真菌的元素組成（按干重%計）1、必須提供合成微生物細(xì)胞和發(fā)酵產(chǎn)物的基本成分基本成分（1）作出細(xì)胞生長和產(chǎn)物形成的化

18、學(xué)計算的平衡 碳源和能源+氮源+其他需要細(xì)胞+產(chǎn)物+CO2+H2O+熱量 通過計算可以獲得生產(chǎn)一定數(shù)量的細(xì)胞時所需要的營養(yǎng)物的最低數(shù)量。在了解一定數(shù)量的生物體所能生產(chǎn)出的產(chǎn)物的數(shù)量后，就有可能計算出形成產(chǎn)物時所需的底物數(shù)量。 這些培養(yǎng)基的基本組分的數(shù)量僅僅是供給細(xì)胞形成產(chǎn)物，而不包括生產(chǎn)細(xì)胞所需要的營養(yǎng)。所有上述各項(xiàng)數(shù)量，是不易獲得其精確數(shù)字的。（2）組成微生物的元素包括C、H、O、N、S、P、Mg和K（見上表），這些元素都要在方程式中予以平衡 在培養(yǎng)基中有些元素的含量往往超過需要量，如P和K。而其他元素含量則接近最低值，如Zn、Cu等。在許多培養(yǎng)基中增加磷酸鹽濃度，其用意是增加培養(yǎng)基的緩沖容

19、量，這一點(diǎn)，在設(shè)計培養(yǎng)基時要引起注意。（3）有些微生物不能合成的特定營養(yǎng)物，如氨基酸、維生素或核苷酸，需要在培養(yǎng)基中加入適量的純凈的化合物或含有該物質(zhì)的混合物。（4）有些發(fā)酵產(chǎn)物，如抗生素等，除了配制培養(yǎng)基以外，還要通過中間補(bǔ)料法，一面對碳及氮的代謝予以適當(dāng)?shù)目刂?，一面間歇添加各種養(yǎng)料和前體類物質(zhì)，引導(dǎo)發(fā)酵走向合成產(chǎn)物的途徑。2、根據(jù)經(jīng)濟(jì)效益經(jīng)濟(jì)效益選擇培養(yǎng)基原料 考慮經(jīng)濟(jì)節(jié)約，盡量少用或不用主糧，努力節(jié)約用糧，或以其他原料代糧。 糖類是主要的碳源。碳源的代用方向主要是尋找植物淀粉、纖維水解物，以廢糖蜜代替淀粉、糊精和葡萄糖，以工業(yè)葡萄糖代替食用葡萄糖。同時，使用稀薄的培養(yǎng)基，適當(dāng)減少碳氮配比

20、。 石油作為碳源的微生物發(fā)酵不但可以生產(chǎn)以糧食為碳源的發(fā)酵產(chǎn)品。 有機(jī)氮源的節(jié)約和代替主要為減少或代替黃豆餅粉、花生餅粉、食用蛋白胨和酵母粉等含有豐富蛋白質(zhì)的原料。代用的原料可以是棉籽餅粉、玉米漿、蠶蛹粉、雜魚粉、黃漿水或麩汁、飼料酵母、石油酵母、骨膠、菌體、酒糟，以及各種食品工業(yè)下腳料等。這些代用品大多蛋白質(zhì)含量豐富，氮源充足，價格低廉，便于就地取材，方便運(yùn)輸。3、有利于減少培養(yǎng)基原料的單耗減少培養(yǎng)基原料的單耗，即提高單位營養(yǎng)物質(zhì)所合成產(chǎn)物數(shù)量或最大產(chǎn)率。4、有利于提高培養(yǎng)基和產(chǎn)物的濃度，以提高單位容提高單位容積發(fā)酵罐的生產(chǎn)能力積發(fā)酵罐的生產(chǎn)能力。5、有利于提高產(chǎn)物的合成速度提高產(chǎn)物的合成速

21、度，縮短發(fā)酵周期。6、盡量減少副產(chǎn)物的形成減少副產(chǎn)物的形成，便于產(chǎn)物的分離純化。7、所用原料盡可能減少對發(fā)酵過程中通氣攪拌的影響，利于提高氧的利用率提高氧的利用率，降低能耗。8、有利于產(chǎn)品的分離純化，并盡可能減少產(chǎn)生減少產(chǎn)生“三三廢廢”的物質(zhì)的物質(zhì)。三、培養(yǎng)基的優(yōu)化 在對培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化的實(shí)際工作中，常常需要同時考察 3個或3個以上的試驗(yàn)因素，若進(jìn)行全面試驗(yàn)，則試驗(yàn)的規(guī)模將很大，往往因試驗(yàn)條件的限制而難于實(shí)施 。正交正交設(shè)計就是安排多因素試驗(yàn)、尋求最優(yōu)水平設(shè)計就是安排多因素試驗(yàn)、尋求最優(yōu)水平組合的一種高效率試驗(yàn)設(shè)計方法。組合的一種高效率試驗(yàn)設(shè)計方法。 正交設(shè)計的基本特點(diǎn)基本特點(diǎn)是：用部分試驗(yàn)來代

22、替全面試驗(yàn)，通過對部分試驗(yàn)結(jié)果的分 析，了解全面試驗(yàn)的情況。正交試驗(yàn)在培養(yǎng)基組成中確定應(yīng)用舉例 例：要確定玉米粉(2%、3.5%、5.0%)、麩皮(1%、2%、3%)和培養(yǎng)時間（6、8、10天）對菌絲產(chǎn)量的影響，確定出哪一個組合最的培養(yǎng)基配比最利于菌絲體生長。 全面試驗(yàn)：如果把全部的實(shí)驗(yàn)組合都計算的話，按照排列組合為33=27個實(shí)驗(yàn)。 3個因素的選優(yōu)區(qū)可以用一個立方體表示(圖11-2)，3個因素各取 3個水平，把立方體劃分成27個格點(diǎn)，反映在 圖11上就是立方體內(nèi)的27個“.”。若27個網(wǎng)格點(diǎn)都試驗(yàn)，就是全面試驗(yàn)，其試驗(yàn)方案如表11所示。 正交設(shè)計：就是從選優(yōu)區(qū)全面試驗(yàn)點(diǎn)（水平組合）中挑選出有

23、代表性的部分試驗(yàn)點(diǎn)（水平組合）來進(jìn)行試驗(yàn)。圖11-A中標(biāo)有試驗(yàn)號的九個“()”，就是利用正交表L9(34)從27個試驗(yàn)點(diǎn)中挑選出來的9個試驗(yàn)點(diǎn)。即：根據(jù)已知的正交表來安排試驗(yàn)組合 常用的正交表已由數(shù)學(xué)工作者制定出來，供進(jìn)行正交設(shè)計時選用。常用的正交表已由數(shù)學(xué)工作者制定出來，供進(jìn)行正交設(shè)計時選用。2水平正交表除水平正交表除L8(27)外，還有外，還有L4(23)、L16(215)等；等；3水平正交表有水平正交表有L9(34)、L27(213)等。等。 記號為記號為L9(34)，其中，其中“L”代表正交表；代表正交表；L右下角的數(shù)字右下角的數(shù)字“9”表示有表示有9行行 ，用這張正交表安排試驗(yàn)包含，

24、用這張正交表安排試驗(yàn)包含3個處理個處理(水平組合水平組合) ；括號內(nèi)的底數(shù)；括號內(nèi)的底數(shù)“3” 表示因素的水平數(shù)，括號內(nèi)表示因素的水平數(shù)，括號內(nèi)3的指數(shù)的指數(shù)“4”表示有表示有4列列 ，也指安排，也指安排的因素數(shù)，用這張正交表最多可以安排的因素數(shù)，用這張正交表最多可以安排4個個3水平因素。水平因素。 根據(jù)試驗(yàn)確定每種組合所得到的檢測標(biāo)準(zhǔn)的量統(tǒng)計分析：直觀分析法和交叉因素分析 均衡分散性：數(shù)據(jù)點(diǎn)分布是均勻的，每一個面都有均衡分散性：數(shù)據(jù)點(diǎn)分布是均勻的，每一個面都有3個點(diǎn)，每一條個點(diǎn)，每一條線都有線都有1個點(diǎn)；個點(diǎn)； 整齊可比性：在這整齊可比性：在這9個水平組合中，個水平組合中，A因素各水平下包括

25、了因素各水平下包括了B、C因素的因素的3個水平，雖然搭配方式不同，但個水平，雖然搭配方式不同，但B、C皆處于同等地位，當(dāng)皆處于同等地位，當(dāng)比較比較A因素不同水平時，因素不同水平時，B因素不同水平的效應(yīng)相互抵消，因素不同水平的效應(yīng)相互抵消，C因素不因素不同水平的效應(yīng)也相互抵消。所以同水平的效應(yīng)也相互抵消。所以A因素因素3個水平間具有可比性。同個水平間具有可比性。同樣，樣，B、C因素因素3個水平間亦具有可比性。個水平間亦具有可比性。正交分析的均衡分散性和整齊可比性 正交試驗(yàn)設(shè)計的基本步驟正交試驗(yàn)設(shè)計的基本步驟 正交試驗(yàn)設(shè)計（簡稱正交設(shè)計）的基本程序是正交試驗(yàn)設(shè)計（簡稱正交設(shè)計）的基本程序是設(shè)計試驗(yàn)

26、方案和處理試驗(yàn)結(jié)果兩大部分。主要步驟設(shè)計試驗(yàn)方案和處理試驗(yàn)結(jié)果兩大部分。主要步驟可歸納如下：可歸納如下： 第一步，明確試驗(yàn)?zāi)康?，確定考核指標(biāo)。第一步，明確試驗(yàn)?zāi)康?，確定考核指標(biāo)。 第二步，挑因素，選水平。第二步，挑因素，選水平。 第三步，選擇合適的正交表。第三步，選擇合適的正交表。 第四步，進(jìn)行表頭設(shè)計。第四步，進(jìn)行表頭設(shè)計。 第五步，確定試驗(yàn)方案。第五步，確定試驗(yàn)方案。 第六步，試驗(yàn)結(jié)果分析。第六步，試驗(yàn)結(jié)果分析。本章主要內(nèi)容 第一節(jié) 發(fā)酵營養(yǎng)基質(zhì)的組成 第二節(jié) 工業(yè)發(fā)酵中營養(yǎng)基質(zhì)的種類 第三節(jié) 培養(yǎng)基的確定和優(yōu)化 第四節(jié)第四節(jié) 原料的選擇及工業(yè)發(fā)酵中原料的選擇及工業(yè)發(fā)酵中 重要營養(yǎng)基質(zhì)的配

27、制方法重要營養(yǎng)基質(zhì)的配制方法第四節(jié) 原料的選擇及工業(yè)發(fā)酵中重要營養(yǎng)基質(zhì)的配制方法一、原料的定義及選擇原則1、原料的定義：從工藝角度來講，凡是能被微生物利用并轉(zhuǎn)化成所需的代謝產(chǎn)物或菌體的物料，都可作為發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)的原料。2、原料選擇的原則 資源豐富，價格低廉，易收集，易儲藏，對人體無害，影響發(fā)酵過程的雜質(zhì)含量應(yīng)極少或幾乎不含，適合微生物的需要和吸收利用，對生產(chǎn)中除發(fā)酵以外的其他方面，如通氣、攪拌、精制、廢棄物處理等帶來的困難最少。二、常用主要原料常用原料種類 薯類：甘薯、馬鈴薯、木薯、山藥等。 糧谷類：高粱、玉米、大米、谷子、大麥、小麥、燕麥等。 野生植物：橡籽仁、葛根、土茯苓、蕨根、石蒜、金剛

28、頭、香附子等。 農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物：米糠餅、麩皮、高粱糠、淀粉渣等。 非糧食生物質(zhì)原料：纖維素、木質(zhì)素、半纖維素等。三、發(fā)酵工業(yè)中重要營養(yǎng)基質(zhì)的配制方法1、淀粉的組成和特性（1）淀粉顆粒的外觀 淀粉顆粒呈白色，不溶于冷水和有機(jī)溶劑，其內(nèi)部呈復(fù)雜的結(jié)晶組織。隨原料品種和種類的不同，淀粉顆粒具有不同的形狀和大小。形狀不規(guī)則，大致上可分為圓形、橢圓形和多角形。 一般說來，水份含量高，蛋白少的植物，顆粒較大，形狀較整齊，大多為圓形或卵形，如馬鈴薯、甘薯的淀粉。 顆粒較大的薯類淀粉較易糊化，顆粒較小的谷物淀粉相對較難糊化。偏光顯微鏡下淀粉顆粒的偏偏光十字光十字(400倍) 顯微鏡下淀粉顆粒結(jié)構(gòu)板栗淀粉粒（

29、一）淀粉質(zhì)原料制糖工藝及培養(yǎng)基的配制方法秈米淀粉粒偏光顯微鏡下淀粉顆粒的偏偏光十字光十字(400倍) 顯微鏡下淀粉顆粒結(jié)構(gòu)薏米淀粉粒（2）淀粉分子的組成 淀粉的本質(zhì)是由葡萄糖脫水聚合而成的，可以表示為（C6H10O5）n?？煞譃橹边B淀粉和支鏈淀粉，直鏈淀粉通過-1，4鍵連接。支鏈淀粉的直鏈部分通過-1，4鍵連接，分支點(diǎn)則有-1，6鍵連接。 支鏈淀粉淀粉分子顆淀粉分子顆粒構(gòu)成過程：粒構(gòu)成過程：淀粉分子鏈淀粉分子鏈針狀晶體針狀晶體淀粉顆粒淀粉顆粒氫鍵氫鍵聚集聚集淀粉分子顆淀粉分子顆粒構(gòu)成過程：粒構(gòu)成過程：淀粉分子鏈淀粉分子鏈針狀晶體針狀晶體淀粉顆粒淀粉顆粒氫鍵氫鍵聚集聚集（3）淀粉的理化性質(zhì) 淀粉

30、一般呈白色粉末狀，在熱水中能溶脹。純支鏈淀粉能溶于冷水中，而直鏈淀粉不能，直鏈淀粉能溶于熱水。 淀粉沒有還原性，也沒有甜味，不溶于冷水、也不溶于酒精、乙醚等有機(jī)溶劑。 糊化糊化：淀粉在熱水中能吸收水分而膨脹，最后淀粉顆粒破裂，淀粉分子溶于水中形成一種均一的糊狀膠體溶液，這就是糊化。 溶解或液化溶解或液化：淀粉糊化后，如果提高溫度至 130，由于支鏈淀粉的全部（幾乎）溶解，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)徹底破壞，淀粉溶液的粘度迅速下降，變?yōu)榱鲃有暂^好的醪液，這種現(xiàn)象稱為淀粉的溶解或液化。 利用淀粉質(zhì)原料制備淀粉要經(jīng)過粗淀粉的精制過程，除去蛋白質(zhì)、纖維素、脂類物質(zhì)、灰分等。精制后的淀粉純度為83%84%。2、淀粉水解的

31、原理（1）淀粉的水解反應(yīng) 淀粉糖化中的主要反應(yīng)，本質(zhì)是-1，4鍵和-1，6鍵被打開，分子量逐漸減小，糖苷鍵的斷裂是隨機(jī)的。反應(yīng)趨勢是：淀粉糊精低聚糖葡萄糖。 糊精：糊精：淀粉經(jīng)酶法或化學(xué)方法水解得到的降解產(chǎn)物，為數(shù)個至數(shù)十個葡萄糖單位的寡糖和聚糖的混合物。 麥芽糖麥芽糖 (maltose )：兩個葡萄糖分子以-1，4-糖苷鍵連接構(gòu)成的二糖。為淀粉經(jīng)淀粉酶作用下得到的產(chǎn)物。 （2）葡萄糖的復(fù)合反應(yīng) 葡糖在熱和酸的情況下發(fā)生聚合反應(yīng)，生成異麥芽糖、龍膽二糖等等，反應(yīng)可逆，可經(jīng)過再加酸水解一次來減少。（3）葡萄糖的分解反應(yīng) 葡糖發(fā)生的較弱的脫水反應(yīng)，生成5-羥甲基糠醛，又進(jìn)一步分解為乙酰丙酸、甲酸等

32、，這些物質(zhì)相互聚合，或與氨基酸聚合，生成有色物質(zhì)。淀粉淀粉水解反應(yīng)糊精水解反應(yīng)麥芽糖葡萄糖復(fù)合反應(yīng)分解反應(yīng)復(fù)合二糖5-羥甲基糠醛低聚糖有機(jī)酸、有色物質(zhì)圖 淀粉水解過程中發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)3、淀粉水解糖制備方法概述（1）酸解法（）酸解法（acid hydrolysis method）是淀粉水解糖制備的傳統(tǒng)方法，它是以無機(jī)酸（現(xiàn)在也用有機(jī)酸）為催化劑，在高溫高壓下將淀粉水解為葡萄糖的方法。 優(yōu)點(diǎn)：工藝簡單、水解時間短、設(shè)備生產(chǎn)能力大。目前廣泛采用此法。 缺點(diǎn)：高溫高壓以及酸的腐蝕對設(shè)備有一定要求；副反應(yīng)多，影響水解液質(zhì)量；對原料要求嚴(yán)格，原料淀粉顆粒必須大小均勻，否則造成水解不均一不徹底；廢水難處理。

33、（2）酶解法（）酶解法（enzyme hydrolysis method ）是用專一性很強(qiáng)的淀粉酶將原料淀粉水解為糊精和低聚糖，在用糖化酶繼續(xù)水解為葡糖的制糖工藝。酶解法一般分為兩步進(jìn)行：液化（liquification）和糖化（saccharification），因?yàn)槎加玫矫?，所以又稱雙酶水解法（double-enzyme hydrolysis method ）。 優(yōu)點(diǎn)：條件溫和，設(shè)備要求低；酶專一性強(qiáng)，副反應(yīng)少；淀粉液初始濃度較高，要求較低（顆粒大小可以不均一）；糖液顏色淺，較純凈。 缺點(diǎn)：生產(chǎn)周期長（常需要數(shù)十個小時），需要專門設(shè)備（如培養(yǎng)酶的設(shè)備），過濾困難（酶是蛋白質(zhì)）。但隨著酶制劑

34、工業(yè)的發(fā)展，酶法取代酸法是淀粉水解糖技術(shù)發(fā)張的必然趨勢。（3）酸酶結(jié)合法（）酸酶結(jié)合法（acid-enzyme hydrolysis method）是結(jié)合了酸法和酶法的水解糖制備工藝，兼具兩者特點(diǎn)。又可分為酸酶法和酶酸法兩種。u酸酶法：先將淀粉用酸水解成低聚糖和糊精，在用糖化酶將其水解為葡萄糖的工藝。有些原料的淀粉，如玉米、小麥的淀粉顆粒堅(jiān)實(shí)，用-淀粉酶短時間內(nèi)往往作用不徹底，因此有些工廠就先用酸將淀粉水解到一定程度（DE值約為15），再用糖化酶糖化，解決了這一問題。u酶酸法：是先用-淀粉酶將原料淀粉水解到一定程度，過濾除去雜志后，再用酸完全水解的工藝。該法適用于較粗的原料，如大米淀粉，可以彌

35、補(bǔ)酸法對原料要求較高的缺點(diǎn)，提高原料利用率。表 酸法和酶法制糖工藝比較比較項(xiàng)目酸 法酶 法葡萄糖值（DE值）9198淀粉原料濃度18%21%34%40%葡萄糖含量（干重）86%97%灰分1.6%0.1%蛋白質(zhì)0.08%0.1%5-羥甲基糠醛0.3%0.003%色度10.00.2淀粉轉(zhuǎn)化率90%98%工藝條件高溫高壓較溫和過程能耗高低副產(chǎn)物多少生產(chǎn)周期短長設(shè)備規(guī)模小大設(shè)備生產(chǎn)能力大小設(shè)備要求耐高溫高壓，耐腐蝕不需耐高溫高壓，耐腐蝕葡萄糖收率較低較酸法高約10%4、淀粉酸水解法工藝流程（1）淀粉酸解法工藝流程：淀粉調(diào)漿過篩加酸進(jìn)料糖化放料冷卻中和脫色過濾糖液u中和：從糖化鍋出來的糖化液是酸性的，淀

36、粉漿的pH一般1.5左右，所以必須先中和，且中和可以通過等電點(diǎn)將蛋白質(zhì)和氨基酸雜質(zhì)去掉。一次中和pH：4.85.0，二次中和pH：6.77.0。用純堿和燒堿中和，前者要避免產(chǎn)生泡沫，后者要邊攪邊加避免局部過堿產(chǎn)生焦糖。從糖化鍋出來的糖化液溫度很高（140150），需先通過緩沖桶降溫至70 80。u脫色：除去對發(fā)酵過程和發(fā)酵產(chǎn)品不利的雜質(zhì)和有色物質(zhì)。有活性炭法、離子交換樹脂法和新型磺化煤法。u壓濾：溫度適宜：過高使蛋白質(zhì)等雜質(zhì)沉淀不完全，過低糖液粘度過大，一般控制在60 70 ；壓濾機(jī)要定時出渣，防止濾布堵塞；濾布保持清潔，經(jīng)常清洗。（2）酸水解技術(shù)條件一般選擇和原因： 淀粉乳濃度18%21%：

37、濃度低，水解容易，糖液DE值高，質(zhì)量高，但是原料的糖化速度低；反之糖化質(zhì)量下降但速度較快。一般精制淀粉乳的濃度可比粗制淀粉乳濃度選擇高些。 鹽酸用量為干淀粉的0.5% 0.8%，使淀粉乳pH達(dá)到1.5左右：酸提供H+，是反應(yīng)的催化劑，酸用量大，水解快，但副反應(yīng)也強(qiáng)。 進(jìn)料壓力0.02 0.03MPa； 水解壓力0.28 0.32MPa：淀粉水解的加熱介質(zhì)是水蒸氣，由于糖化鍋有專門管道不斷排出不凝性氣體，因此鍋內(nèi)充滿水蒸氣，其溫度和壓力是正相關(guān)的。工業(yè)上一般控制壓力，壓力低水解慢，壓力高雖然水解快，但副反應(yīng)也快，并且鍋體腐蝕也快。 水解時間一般15min左右：糖化鍋容積不能太大，保證進(jìn)料放料迅速

38、，保證在有效的時間內(nèi)蒸汽能均勻地作用于底物，避免水解不徹底，且盡量避免副反應(yīng)；糖化鍋附屬管道設(shè)計也應(yīng)盡量保證縮短輔助時間。 水解終點(diǎn)檢查，一般用無水酒精檢查無白色無水酒精檢查無白色反應(yīng)為止反應(yīng)為止。圖 典型糖化鍋構(gòu)造1、原料淀粉進(jìn)口1；2、熱水進(jìn)口；3、攪拌器；4、加熱蒸汽管道進(jìn)口；5、蒸汽冷凝水出口；6、糖化液放料口；7、不凝性氣體排出口；8耳架；9、原料淀粉進(jìn)料口2；10、環(huán)形槽；11、污水排出口；12、風(fēng)門（3）淀粉酸水解過程中的一些因素 淀粉乳濃度：濃度低，水解容易，糖液DE值高，質(zhì)量高，但是原料的糖化速度低；反之糖化質(zhì)量下降但速度較快。一般精制淀粉乳的濃度可比粗制淀粉乳濃度選擇高些。

39、 酸的種類和濃度的影響：酸提供H+，是反應(yīng)的催化劑，酸用量大，水解快，但副反應(yīng)也強(qiáng)。 鹽酸：高效，但中和后產(chǎn)生氯化物，增加糖液灰分，對葡萄糖的結(jié)晶，分離及收率會有影響。 硫酸：能力僅次于鹽酸，用碳酸鈣中和，經(jīng)脫色，離子交換可除去。 草酸：能力低，用石灰中和生成草酸鈣，脫色過濾易除去，非強(qiáng)酸，減少了復(fù)合反應(yīng)。 糖化溫度和時間：淀粉水解的加熱介質(zhì)是水蒸氣，由于糖化鍋有專門管道不斷排出不凝性氣體，因此鍋內(nèi)充滿水蒸氣，其溫度和壓力是正相關(guān)的。工業(yè)上一般控制壓力，壓力低水解慢，壓力高雖然水解快，但副反應(yīng)也快，并且鍋體腐蝕也快。5、淀粉酶水解法工藝流程酶法主要用到-淀粉酶和糖化酶兩種酶，因此又叫雙酶水解法

40、。淀粉酶解法工藝流程：液化糖化滅酶過濾貯糖計量發(fā)酵 （1）液化：u 定義：定義：雙酶水解法的第一個步驟，使用-淀粉酶的催化作用水解原料淀粉，使淀粉液黏度不斷下降，流動性增強(qiáng)的過程。國內(nèi)一般使用的-淀粉酶來源于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），作用于-1,4糖苷鍵，可越過-1,6糖苷鍵作用于直連淀粉和支鏈淀粉，主要產(chǎn)物是麥芽糖和葡萄糖。u 工藝要點(diǎn)：工藝要點(diǎn)： 淀粉狀態(tài)淀粉狀態(tài)：淀粉在液化前必須先糊化，破壞其晶體結(jié)構(gòu)，使淀粉分子浸出，再加入-淀粉酶。酶只在淀粉顆粒表面反應(yīng)，淀粉顆粒的水解速度和淀粉糊化液的水解速度之比為1:20000。 溫度溫度： 目前-淀粉酶的最適作用溫度為4

41、0。但生產(chǎn)上為盡快完成液化，一般溫度為8090，并加入鈣離子作為保護(hù)劑。研究耐高溫的-淀粉酶是雙酶水解法的熱點(diǎn)問題。 pH值值： -淀粉酶在pH6.0 7.0穩(wěn)定，最適pH為6.27.4 。但也與溫度有關(guān)系。 其他因素其他因素：淀粉乳中的淀粉和糊精本身對酶有保護(hù)作用； -淀粉酶是金屬酶，活性依賴鈣離子；酶的用量，這依淀粉酶的活力和原料而定。 液化程度的控制液化程度的控制：酶法液化雖然副產(chǎn)物少，但時間較長以后也會使產(chǎn)物重新結(jié)合成大分子（類似淀粉糊化時間過長引起的淀粉老化現(xiàn)象），影響下一步糖化。因此一般液化時間控制在10 15min，DE值10 20即可。用碘液顯色法控制液化終點(diǎn)(見下表)。 葡萄糖聚合度與碘液呈色最高吸收波長（nm）78無色48016淡紅色51021紅色54028紅紫色56034紫色58041蘭紫色60061蘭色620120蘭色630330蘭色630葡萄糖聚合度與碘液的呈色表（2）糖化：u 定義：定義：利用糖化酶（又稱葡萄糖淀粉酶）將-淀粉酶產(chǎn)生的液化產(chǎn)物進(jìn)一步水解成葡萄糖。糖化酶的作用方式是從底物的非還原糖末端開始切下葡萄糖單位，產(chǎn)生-葡萄糖，是外切酶。即可作用于-1,4糖苷鍵，也可作用于-1,6糖苷鍵，但速度較慢，約為前者的1/3。u 工藝要點(diǎn)：工藝要點(diǎn)：