再生障礙性貧血血管內(nèi)皮生長因子表達及其意義的研究

1、再生障礙性貧血血管內(nèi)皮生長因子表達及其意義的研究 作者：季健玲，劉紅，孫超，姜勝華，丁潤生【摘要】 本研究目的是探討再生障礙性貧血骨髓血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達情況，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法半定量檢測7例再生障礙性貧血患者和12例正常人骨髓單個核細胞VEGF基因的表達；用免疫組織化學(xué)法檢測20例再生障礙性貧血患者和20例正常人骨髓組織中VEGF的表達。結(jié)果表明，7例再生障礙性貧血患者骨髓標本有2例表達VEGF 基因，表達率為28.57，而12份正常人骨髓標本有10例表達VEGF基因，表達率為83.33；再生障礙性貧血患者VEGF基因表達率和表達強度都顯著低于正常人，兩者

2、差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，再生障礙性貧血患者骨髓活檢組織無1例表達VEGF，而正常人表達率為25（5/20），再生障礙性貧血患者骨髓活檢組織VEGF蛋白表達陽性率低于正常人（P<0.05）。結(jié)論： 再生障礙性貧血患者骨髓VEGF在基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)表達水平都有顯著降低，這可能與再生障礙性貧血患者骨髓血管生成減少和造血減少有一定關(guān)系。 【關(guān)鍵詞】 再生障礙性貧血Expression of Vascular Endothelial Growth Factor in Patients with Aplastic Anemia and Its Signif

3、icanceAbstract This study was aimed to investigate the expression of vascular endothelial growth factor （VEGF） in patients with aplastic anemia.The gene expressions of VEGF in mononuclear cells of bone marrow from 7 cases of aplastic anemia and 12 normal controls were detected by semi-quantitative r

4、everse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR). The expressions of VEGF in bone marrow from 20 cases of aplastic anemia and 20 normal controls were also determined by immunohistochemistry assay. The results showed that expression of VEGF mRNA was found in 2 out of 7 (28.57) bone marrow of pa

5、tients and in 10 out of 12 (83.33%) bone marrow of normal controls.The VEGF mRNA in patients with aplastic anemia was significantly lower than that in normal controls (P<0.05).No patients with aplastic anemia showed immunohistochemical staining of VEGF in bone marrow，while 5 out of 20 (25%) norma

6、l controls exhibited VEGF positive cells.Bone marrow of aplastic anemia patients contained less VEGF than that of normal persons (P<0.05). In conclusion，when compared with normal controls，VEGF expression decreased significantly in patients with aplastic anemia at gene transcription level and prot

7、ein translation level，it may be related to the defect of angiogenesis and thus hematopoiesis in bone marrow of patients with aplastic anemia.Key words aplastic anemia; vascular endothelial growth factor; gene expression; reverse transcriptase polymerase chain reaction; immunohistochemistry 再生障礙性貧血的發(fā)

8、病機制至今尚未完全明確。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作為一種多功能的生長因子，能促進內(nèi)皮細胞增殖和血管生成、增加血管通透性，其在各種生理和病理過程中的作用已經(jīng)成為近年來研究的熱點，有關(guān)VEGF在各種惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展中作用的研究正方興未艾1。近5年來的研究表明，VEGF在多種血液病的發(fā)生和發(fā)展中起著非常重要的作用2，但是目前尚無VEGF與再生障礙性貧血關(guān)系的報道。本研究主要通過逆轉(zhuǎn)錄酶鏈聚合反應(yīng)、免疫組織化學(xué)的方法分別在基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯水平檢測再生障礙性貧血患者VEGF的表達情況，以探討其在再生障礙性貧血發(fā)病中的作用。

9、材料和方法骨髓標本新鮮骨髓標本 7 例再生障礙性貧血者的新鮮骨髓標本均來自2003年7月-2004年1月本院門診及住院患者，按照張之南診斷標準37例患者均確診為再生障礙性貧血。12例正常新鮮骨髓標本來自正常人。骨髓活檢標本20例再生障礙性貧血者骨髓活檢標本均取自2002年12月-2004年2月之間本院門診或住院病人骨髓組織；20例正常骨髓活檢標本取自正常人骨髓組織。這些標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋，以4 m厚度切片。復(fù)閱原始病歷，在20例再生障礙性貧血患者中，重型再生障礙性貧血和非重型再生障礙性貧血分別為6例和14例；其中男性11例，女性9例，平均年齡32（15-68）歲。主要器械

10、Enppendorf蛋白核酸定量儀（德國 Biophotometer 公司產(chǎn)品）；低溫超速冷凍離心機（3K30，美國Sigma公司產(chǎn)品）；梯度PCR擴增儀（美國Touchgene公司產(chǎn)品）；凝膠圖像處理系統(tǒng)（SX-100 WVPB310，上海四星生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品）；真彩醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（Syngene公司產(chǎn)品）；雙目顯微鏡（OLYMPUS-CX40）。主要試劑VEGF、-actin引物由上海生工生物有限公司合成；TrizoL Reagent（Gibcol公司）；AMV First Strand cDNA synthesis Kit、DEPC、瓊脂糖（BBI公司）；Taq DNA polym

11、erase、DL2000 DNA Marker（TaKaRa公司）；膠回收試劑盒（上海華舜生物工程有限公司）；人VEGF單克隆抗體（Oncogene公司）。RT-PCR方法用Ficoll分離液分離骨髓單個核細胞，TrizoL法提取細胞內(nèi)總RNA，在Enppendorf蛋白核酸定量儀上測定A260/A280比值，鑒定RNA純度和定量，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA（按BBI逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作步驟進行），PCR擴增。引物設(shè)計與合成 所有基因均通過GenBank數(shù)據(jù)庫檢索其cDNA序列，合成的兩對引物如下。PCR擴增條件94預(yù)變性3分鐘后進入32次循環(huán)： 94，30秒58，30秒72，30秒（其中-actin

12、上下游引物待VEGF擴增體系循環(huán)7次后加入，繼續(xù)共同循環(huán)25次），循環(huán)結(jié)束后72延伸5分鐘，4保存。PCR產(chǎn)物的檢測和分析 取PCR產(chǎn)物10 l加入6上樣緩沖液2 l混合上樣，與DNA marker同時在含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠上電泳分離，將凝膠置四星圖像分析儀攝像，采用Quantity One圖像分析軟件（Bio-Rad公司）進行半定量分析，為減少誤差，以去除底色密度的VEGF帶與內(nèi)參-actin帶掃描密度比表示VEGF mRNA的相對表達量。凝膠PCR產(chǎn)物回收、測序PCR產(chǎn)物回收按照上海華舜生物工程有限公司試劑盒說明書操作步驟進行，回收產(chǎn)物送上海博亞公司測序。骨髓活檢組織VEGF免疫組織

13、化學(xué)檢測采用免疫組織化學(xué)Envision法染色，并參照參考文獻4，由兩位病理醫(yī)師在盲法下獨立觀察，每張切片至少選擇5個具有代表性的高倍視野。VEGF陽性信號為高倍鏡下見到胞漿或胞膜有棕黃色顆粒。統(tǒng)計學(xué)分析采用STATA 7.0統(tǒng)計軟件進行分析。RT-PCR實驗結(jié)果分析：表達率的比較采用Fisher確切概率法檢驗；表達強度的等級分布比較采用Wilcoxon秩和檢驗。免疫組織化學(xué)結(jié)果分析采用卡方檢驗。結(jié)果PCR回收產(chǎn)物測序結(jié)果經(jīng)過基因測序并通過在GenBank 上BLAST證實，PCR擴增的259 bp片段產(chǎn)物與人類VEGF基因100同源。測序報告見圖1。再生障礙性貧血患者和正常人骨髓單個核細胞V

14、EGF基因表達比較12例正常人骨髓單個核細胞（主要為髓系造血細胞、淋巴細胞和部分骨髓基質(zhì)細胞）中有10例表達VEGF基因，表達率為83.33（10/12），7例再生障礙性貧血患者中僅2例陽性，表達率為28.57，表達結(jié)果見圖2，再生障礙性貧血患者 VEGF 基因表達率低于正常人（P0.05）。經(jīng)熒光半定量分析，結(jié)果顯示再生障礙性貧血患者VEGF基因表達強度亦低于正常人（P0.05）。骨髓活檢標本VEGF免疫組織化學(xué)檢測VEGF表達主要位于胞漿內(nèi)，20例再生障礙性貧血患者骨髓組織中無1例表達VEGF，而20例正常骨髓中有5例表達VEGF，表達率為25（5/20），但陽性細胞數(shù)比例較少（圖3），再

15、生障礙性貧血組骨髓VEGF表達比正常組低（P0.05）。討 論自1898年P(guān)aul首次報道再生障礙性貧血以來，人們經(jīng)過100余年的探索，已經(jīng)逐步加深了對該疾病發(fā)病機理的認識。目前國內(nèi)外學(xué)者研究認為，再生障礙性貧血是一種骨髓造血功能過分抑制性疾病，其病理機制呈高度異質(zhì)性，造血干細胞增殖缺陷是再生障礙性貧血的主要發(fā)病因素之一。而近年來，VEGF與正常和異常造血的密切關(guān)系正日益受到重視，它是血管生成和造血的重要調(diào)節(jié)因子5。人類VEGF基因位于染色體6P12，全長14 kb，由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成。由于VEGF mRNA有不同的剪接方式，所產(chǎn)生的VEGF蛋白主要有5種亞型，而本研究中設(shè)計的引物對

16、所有亞型均可擴增出259 bp的特異性產(chǎn)物。 本研究采用RT-PCR的方法檢測了再生障礙性貧血患者及正常人骨髓細胞VEGF基因表達的狀況，兩個總體表達率和半定量表達強度的比較統(tǒng)計結(jié)果顯示，再生障礙性貧血病人VEGF mRNA檢測陽性率和陽性強度明顯低于正常人，結(jié)合免疫組織化學(xué)結(jié)果，提示再生障礙性貧血患者VEGF在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的表達都低于正常人。再生障礙性貧血患者低表達VEGF，一方面可能使得其刺激骨髓血管生成減少，而造成骨髓局部血液供給減少，不利于骨髓造血細胞及基質(zhì)細胞的營養(yǎng)和供氧，不利于造血，且VEGF維持血管內(nèi)皮細胞的正常功能作用受到影響，還可能影響正常造血；另一方面，Gerber等

17、6研究發(fā)現(xiàn)，VEGF與生理性造血密切相關(guān)，它通過內(nèi)在的自分泌環(huán)在調(diào)節(jié)、維持造血干細胞的生存和增殖中起著重要的作用，VEGF表達減少可能使其維持造血干細胞的生存、分化和發(fā)育的功能受到直接影響，由此我們推測VEGF的低表達可能和再生障礙性貧血的發(fā)病有一定的關(guān)系。 我們注意到：骨髓中VEGF在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平上的確存在著表達率和表達量的差異，即雖然在轉(zhuǎn)錄水平上VEGF基因有轉(zhuǎn)錄，但蛋白質(zhì)卻不一定表達，可能與轉(zhuǎn)錄后翻譯過程的修飾有關(guān)，其中的具體機制還有待于進一步深入研究。 我們的研究結(jié)果初步表明，VEGF在再生障礙性貧血患者中確實存在表達減少，可以從多方面影響骨髓血管生成和造血干細胞的生存，其在再生

18、障礙性貧血發(fā)病機制中的作用值得進一步深入探討。【參考文獻】 1 Kong HL，Crystal RG.Gene therapy strategies for tumor antiangiogenesis.J Natl Cancer Inst，1998； 90: 273-2862 Bellamy WT，Richter L，F(xiàn)rutiger Y，et al. Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors in hematopoietic mali-gnancies. Cancer Res，1999；59: 728-7333 張之南，沈悌主編.血液病診斷及療效標準.第2版.北京：科學(xué)出版社，1998: 33-354 Hussong JW，Rodgers GM，Shami PJ.Evidence of increased angiogenesis in patients with acute myeloid leukemia.Blood，2000； 95： 309-3135 Bautz F，Rafii S，Kanz L，et al.Expression and secretion of vascular endothelial growth factor-A by cytoki