小鼠白細(xì)胞介素12基因在乳酸乳球菌中的表達(dá)

1、小鼠白細(xì)胞介素-12基因在乳酸乳球菌中的表達(dá) 作者：周強(qiáng)，周巧梅，李云，龐慶豐，曾因明 【摘要】 目的 在乳酸乳球菌中表達(dá)小鼠白細(xì)胞介素-12基因。方法 用Nsi 和EcoR 雙酶切pGEM-IL-12質(zhì)粒后，與經(jīng)同樣酶切的含有乳鏈桿菌肽A（nisA）啟動(dòng)子的pSEC-E7質(zhì)粒連接，從而構(gòu)建成pSEC-IL-12質(zhì)粒；經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌NZ9000中，轉(zhuǎn)化子在含有氯霉素的腦心浸液培養(yǎng)基上培養(yǎng)。用乳鏈桿菌肽（nisin）誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-12表達(dá)，SDSPAGE、Western blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物；用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測IL-12的量。結(jié)果 建立了白細(xì)胞介素-12

2、乳酸菌基因表達(dá)系統(tǒng)。在nisin的誘導(dǎo)下，NZ9000能夠產(chǎn)生并分泌白細(xì)胞介素-12約80 ng/。結(jié)論 乳酸乳球菌能夠表達(dá)一定數(shù)量的小鼠白細(xì)胞介素-12。 【關(guān)鍵詞】 白細(xì)胞介素-12；基因克??；乳酸乳球 白細(xì)胞介素-12（interleukin 12， IL-12）主要由B 細(xì)胞、T 細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有多種功能的細(xì)胞因子。它能夠促進(jìn)NK細(xì)胞、T 細(xì)胞的增殖和殺傷活性， 誘導(dǎo)-干擾素等細(xì)胞因子的產(chǎn)生， 調(diào)節(jié)Th1 細(xì)胞的發(fā)育， 具有良好的臨床應(yīng)用前景。目前已經(jīng)進(jìn)入抗腫瘤、抗病毒性疾病和治療哮喘的期和期臨床試驗(yàn)階段15。人重組IL-12 （recombinant human in

3、terleukin-12， rh IL-12）的臨床試驗(yàn)提示rh IL-12在治療腫瘤、病毒感染性疾病及哮喘中具有肯定的效果。國內(nèi)、外均采用基因工程的技術(shù)使用逆轉(zhuǎn)錄病毒和重組腺病毒載體介導(dǎo)的方法在COS - 7細(xì)胞、肝癌細(xì)胞株中進(jìn)行體外表達(dá)得到rh IL-126-7。但存在著成本昂貴、操作技術(shù)復(fù)雜、表達(dá)量較低、需多次提取純化才能使用等缺點(diǎn)。而如果將攜帶rh IL-12的逆轉(zhuǎn)錄病毒或重組腺病毒載體靜脈注射或局部注射使rh IL-12在體內(nèi)表達(dá)，則存在的主要問題是:轉(zhuǎn)移效率低，免疫原性強(qiáng)，外源基因在細(xì)胞中只能短期表達(dá)8-9。因此尋找一種簡便而又實(shí)用的開發(fā)rh IL-12的方法使其盡快成為一個(gè)新的藥

4、物非常重要。近年來，人們在研究乳酸菌的過程中所建立的乳酸菌基因表達(dá)系統(tǒng)為有效地開發(fā)和利用rh IL-12提供了新的機(jī)遇。本研究報(bào)道了小鼠 IL-12 基因在食品級微生物乳酸乳球菌中的活性表達(dá)，從而為以乳酸乳球菌為基礎(chǔ)的IL-12應(yīng)用研究提供依據(jù)。 1 材料和方法 1.1 質(zhì)粒、菌株及培養(yǎng)條件 乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）NZ9000和pSEC-E7質(zhì)粒為法國農(nóng)業(yè)科學(xué)院Luis教授贈(zèng)送，大腸桿菌DH5、pGEM-IL-12載體為本實(shí)驗(yàn)室保存；其中大腸桿菌DH5用于質(zhì)粒pSEC-E及其衍生質(zhì)粒保存或擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)菌株，乳酸乳球菌NZ9000 用作IL-12基因重組表達(dá)質(zhì)粒pSEC

5、-IL-12的表達(dá)菌株。大腸桿菌用LB培養(yǎng)基、乳酸乳球菌及其電穿孔轉(zhuǎn)化子用腦心浸液培養(yǎng)基培養(yǎng)。氨芐青霉素使用濃度為100 mg/L，氯霉素使用濃度大腸桿菌為10 mg/L、乳酸乳球菌為5 mg/L。IL-12酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自上海森雄公司。 1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化 重組質(zhì)粒構(gòu)建如下：用Nsi 和EcoR 雙酶切pGEM-IL-12 質(zhì)粒后，與經(jīng)同樣酶切的含有nisA啟動(dòng)子的pSEC-E7質(zhì)粒連接，從而構(gòu)建成pSEC- IL-12質(zhì)粒，pSEC- IL-12質(zhì)粒含有Usp45 信號(hào)肽。乳酸乳球菌轉(zhuǎn)化采用電穿孔轉(zhuǎn)化法，電穿孔儀為美國Bio-Rad公司，脈沖參數(shù)為1.25

6、 kV/mm，25 F和200 。重組質(zhì)粒經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌NZ9000，轉(zhuǎn)化子在含有氯霉素的腦心浸液瓊脂糖平板上生長。再從重組乳酸乳球菌中提取質(zhì)粒 pSEC- IL-12，進(jìn)行電泳鑒定。 1.3 小鼠HO-1基因在乳酸乳球菌中的誘導(dǎo)表達(dá) 含重組質(zhì)粒pSEC- IL-12的乳酸乳球菌NZ9000在腦心浸液培養(yǎng)基中30靜置培養(yǎng)過夜,用新鮮培養(yǎng)基150稀釋，培養(yǎng)至OD6000.50.6時(shí)，加入誘導(dǎo)物Nisin至終濃度10 mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。終止培養(yǎng)后，取2 ml培養(yǎng)菌液，4、8 000 r/min離心5 min，上清液濃縮50倍后經(jīng)15SDS-PAGE電泳分離后，通過Bio-Rad 印跡

7、儀轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上作Western- blot。以空載體Lactococcus lactis為對照。取1 ml培養(yǎng)菌液用ELISA試劑盒測定IL-12的產(chǎn)量。 2 結(jié) 果 2.1 IL-12在細(xì)菌中的轉(zhuǎn)化，提抽，鑒定 將pSEC-IL-12轉(zhuǎn)化至DH5中，提抽質(zhì)粒并做DNA測序，測序結(jié)果見圖1，堿基數(shù)目及順序與預(yù)期設(shè)計(jì)結(jié)果相符合，在LB培養(yǎng)基平板上大量擴(kuò)增細(xì)菌并提取獲得質(zhì)粒，將其再轉(zhuǎn)化到NZ9000。從NZ9000中提取質(zhì)粒做電泳鑒定（圖2）。由圖2可見，在DH5和NZ9000中提抽到的質(zhì)粒DNA分子（條帶1和2）與轉(zhuǎn)化前的pSEC-IL-12（條帶1）在Marker的對照下，條帶處于同一

8、位置高度，說明轉(zhuǎn)化是成功的。 2.2 IL-12蛋白質(zhì)的表達(dá) 在Nisin的誘導(dǎo)下，NZ9000能夠產(chǎn)生并分泌rmIL-12約80 ng/L（見圖3），和野生菌比較，Western blot分析含目的基因的工程菌組在相應(yīng)部位分子量處有條帶出現(xiàn)，而野生菌組則不明顯（圖4）。 3 討 論 乳酸乳球菌是一類長期應(yīng)用于食品發(fā)酵業(yè)的有益微生物，這種食品級微生物能經(jīng)受胃腸液考驗(yàn)并在人體內(nèi)存活2 3天，其本身不攻擊腸黏膜并且不引起強(qiáng)的免疫反應(yīng)10。近年來隨著乳酸乳球菌分子生物學(xué)迅速發(fā)展，一系列乳酸乳球菌基因表達(dá)載體和受體系統(tǒng)逐步建立。乳酸菌存在數(shù)種食品級基因表達(dá)系統(tǒng)，如依賴lac操縱子控制的食品級表達(dá)系統(tǒng)、

9、nisA啟動(dòng)子控制的食品級基因表達(dá)系統(tǒng)和嘌呤調(diào)節(jié)的食品級基因表達(dá)系統(tǒng)等。 本研究所采用的乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)是一種目前國際上高度通用NICE系統(tǒng)（nisin controlled expression system）。該表達(dá)系統(tǒng)包括3種必要的組成成分：能表達(dá)NisR基因到一定水平的革蘭陽性細(xì)菌NZ9000；（nisA） 啟動(dòng)子片段的質(zhì)粒載體；Nisin誘導(dǎo)物，即Nisin作為自身結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄激活的信號(hào)分子。由于NICE表達(dá)系統(tǒng)具有食品級的誘導(dǎo)物和宿主菌、嚴(yán)謹(jǐn)性高、本底表達(dá)水平低、誘導(dǎo)效率高及表達(dá)產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，所以被廣泛地用于外源性基因在乳酸乳球菌中表達(dá)。由于具有自身分泌的蛋白少且不含質(zhì)粒的菌株不產(chǎn)生

10、胞外蛋白水解酶等優(yōu)點(diǎn)，所以越來越多的學(xué)者將乳酸乳球菌作為異源性蛋白表達(dá)載體。目前已有多種異源性蛋白在乳酸乳球菌中成功表達(dá)11-12。然而，如果把乳酸乳球菌用作人類或動(dòng)物消化道中的蛋白載體，那么乳酸乳球菌能夠分泌異源性蛋白則是更佳選擇，因?yàn)檫@樣將更有利于異源性蛋白與其靶位相互作用。正如其他革蘭陽性細(xì)菌，乳酸乳球菌分泌的蛋白首先被合成前體蛋白，即含有信號(hào)肽和成熟的蛋白分子；然后宿主分泌系統(tǒng)識(shí)別前體蛋白并將其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)；最后成熟蛋白釋放至培養(yǎng)基中。因此，信號(hào)肽在乳酸乳球菌蛋白分泌中起至關(guān)重要作用。本實(shí)驗(yàn)成功重組了能夠表達(dá)具有生物活性IL-12乳酸乳球菌，鑒于乳酸乳球菌為存在于胃腸道中的益生菌，因此非常

11、適合于治療腸道疾病如腸炎、腸道腫瘤等疾病。但本研究也發(fā)現(xiàn)乳酸乳球菌表達(dá)的IL-12含量偏少，因此需要進(jìn)一步優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，增加IL-12的表達(dá)數(shù)量。 【參考文獻(xiàn)】 1 OBrien CB， Moonka DK， Henzel BS， et al. A pilot trial of recombinant interleukin-12 in patients with chronic hepatitis C who previously failed treatment with interferon - alphaJ. Am J Gastroenterol，2001，96(8):2473-2

12、479. 2 Ohno R， Yamaguchi Y， Toge T， et al. A dose-escalation and pharmacokinetic study of subcutaneously administered recombinant human interleukin 12 and its biological effects in Japanese patients with advanced malignanciesJ. Clin Cancer Res，2000，6(7)：2661-2669. 3 Jacobson MA， Hardy D， Connick E，

13、et al. Phase 1 trial of a single dose of recombinant human interleukin-12 in human immunodeficiency virus-infected patients with 100-500 CD4 cells/microLJ. J Infect Dis，2000，182(4)：1070-1076. 4 Bryan SA， OConnor BJ， Matti S， et al. Effects of recombinant human interleukin-12 on eosinophils， airway h

14、yper-responsiveness， and the late asthmatic responseJ. Lancet，2000，356（9248）:21492153. 5 Sangro B， Mazzolini G， Ruiz J， et al. Phase I trial of intratumoral injection of an adenovirus encoding interleukin-12 for advanced digestive tumorsJ. J Clin Oncol，2004，22(8):1389-1397. 6 Gabaglia CR， Sercarz EE

15、， Diaz-De-Durana Y， et al. Life-long systemic protection in mice vaccinated with L. major and adenovirus IL-12 vector requires active infection， macrophages and intact lymph nodesJ. Vaccine，2004，23(2):247-257. 7 Liu W， Wei H， Liang S， et al. A balanced expression of two chains of heterodimer protein

16、， the human interleukin-12， improves high-level expression of the protein in CHO cellsJ. Biochem Biophys Res Commun,2004,313(2):287-293. 8 Okada N， Iiyama S， Okada Y, et al. Immunological properties and vaccine efficacy of murine dendritic cells simultaneously expressing melanoma-associated antigen

17、and interleukin-12J. Cancer Gene Ther,2005,12(1):72-83. 9 Triozzi PL， Strong TV， Bucy RP, et al. Intratumoral administration of a recombinant canarypox virus expressing interleukin 12 in patients with metastatic melanomaJ. Hum Gene Ther,2005,16(1):91-100. 10 Klijn N， Weerkamp AH， de Vos WM. Genetic marking of Lactococcus lactis shows its survival in the human gastrointestinal tractJ. Appl Environ Microbiol，1995，61(7):2771-2774. 11 Bermudez-Humaran LG， Langella P， Commissaire J， et al. Controlled intra- or extracell