活血熄風(fēng)方對局灶性腦缺血大鼠血管內(nèi)皮生長因子mRNA表達的影響

1、活血熄風(fēng)方對局灶性腦缺血大鼠血管內(nèi)皮生長因子mRNA表達的影響【摘要】 目的觀察活血熄風(fēng)方對局灶性腦缺血模型大鼠腦梗塞體積及腦組織中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF mRNA）表達的影響。方法Wistar雄性大鼠隨機分為假手術(shù)組，模型組，活血熄風(fēng)方高、中、低3個劑量組（劑量分別為20，10，5 g·kg-1）和尼莫地平對照組（0.02 g·kg-1），采用光化學(xué)法建立局灶性腦缺血大鼠模型，造模前7d灌胃給藥，造模后24 h 取材，TTC染色法測腦梗塞體積，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）法測VEGF mRNA表達。結(jié)果 與模型組比較，活血熄風(fēng)方各劑量組的腦梗塞體積明顯減少（P

2、0.01），VEGF mRNA表達明顯升高 (P0.01)。結(jié)論活血熄風(fēng)方可明顯減少局灶性腦缺血大鼠腦梗塞體積，具有腦保護作用，其作用機制可能與增強VEGF mRNA表達有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 活血熄風(fēng)方；光化學(xué)法；血管內(nèi)皮生長因子mRNA； 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)； 局灶性腦缺血 ChinaAbstract:ObjectiveTo observe the effects of Huoxue Xifeng Recipe (HXR) on infarction volume and the expressions of VEGF mRNA in brain tissue after focal cer

3、ebral infarction(FCI) in rats.MethodsWistar male rats were randomly divided into six groups: sham group, model group, HXR treated group(20，10，5 g·kg-1 as high，middle and low dose respectively) and nimodipine control group(0.02 g·kg-1). The model of FCI was established based on the principl

4、e of photo-chemistry initiation of thrombosis, intragastric administration continued 7 days before modeling and draw the material after 24h. Infarction volume was detected by TTC staining technique, the expression of VEGF mRNA was detected by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).

5、ResultsThe infarction volume was decreased and the expressions of VEGF mRNA was higher in HXR trerted groups than that of FCI model rats (P0.05 or P0.01).ConclusionHXR can decreased infarction volume and has a protective effect on FCI rats, and the mechanism may be related to increasing the expressi

6、on of VEGF mRNA.Key words:Huoxue Xifeng Recipe; Photo-chemistry; VEGF mRNA; RT-PCR; Focal cerebral infarction 腦缺血后，由于腦組織缺血、缺氧，缺血中心區(qū)細(xì)胞迅速死亡，半暗區(qū)神經(jīng)細(xì)胞處于低氧、低灌注狀態(tài)，及時恢復(fù)該區(qū)域血流供應(yīng)有望改善患者的神經(jīng)功能。而半暗區(qū)血流的恢復(fù)有賴于側(cè)枝循環(huán)的建立，血管再生是決定這些細(xì)胞存活的關(guān)鍵因素，與缺血性腦卒中病人的預(yù)后關(guān)系密切1。在血管再生過程中，眾多因子參與調(diào)節(jié)，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VE

7、GF) 是已知作用最強和特異性最高的促血管生長因子2，在血管生成和神經(jīng)保護方面發(fā)揮著重要作用。 活血熄風(fēng)方是在“淤血生風(fēng)”假說3基礎(chǔ)上提出的治療中風(fēng)的新組方，全方以活血化淤為主，通過活血化淤以求逐淤熄風(fēng)，經(jīng)臨床驗證療效滿意，已有實驗證實活血熄風(fēng)方具有腦保護作用4。本實驗用TTC染色法觀察光化學(xué)法誘導(dǎo)的局灶性腦缺血大鼠腦梗塞體積大小，采用RT-PCR技術(shù)觀察VEGFmRNA的表達以及活血熄風(fēng)方對上述方面的干預(yù)作用，來探討活血熄風(fēng)方腦保護的作用機制。1 材料與儀器1.1 動物健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量200250g，山東魯抗醫(yī)藥有限公司提供合格證號：SCXK(魯)20050017。1.2 藥

8、物活血熄風(fēng)方，由當(dāng)歸、紅花、川芎、水蛭等藥物組成，蒸餾水浸泡1 h，水煎2次，30 min/次，兩次煎液混勻，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀分別濃縮至2，1，0.5 g·ml-1，4保存?zhèn)溆?。尼莫地平片，山東魯抗醫(yī)藥集團賽特有限責(zé)任公司生產(chǎn)，每片20 mg，使用前用蒸餾水溶解成含量為2 mg·ml-1的混懸液。1.3 試劑與儀器Trizol Reagent（美國 Invitrogen）；DNA Marker DL2000、Taq 酶、Ribonuclease inhibitor、dNTP Mixture（大連寶生物）；M-MLV Reverse Transcriptase（美國 Promega

9、）；玫瑰紅(美國Sigma) ；紅四氮唑(TTC) （化學(xué)純，北京化工廠）。 梯度PCR系統(tǒng)（ICYCLER型，美國BIO-RAD公司）；DXY-2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀及電泳槽（北京六一儀器廠）；凝膠成像系統(tǒng)（Gel Doc 2000型，美國BIO-RAD公司）；低溫高速離心機（Sigma3k30，德國Sigma公司）；紫外分光光度儀（UV-1601 型，日本島津）；立體定位儀（美國Stoelting公司）；IPP圖像采集分析系統(tǒng)（美國）。2 方法2.1 分組與給藥大鼠隨機分為6組：假手術(shù)組、模型組、活血熄風(fēng)方高劑量組、活血熄風(fēng)方中劑量組、活血熄風(fēng)低劑量組、尼莫地平對照組，每組12只，其中6只用于T

10、TC染色，6只用于RT-PCR。各組均給予手術(shù)造模，假手術(shù)組股靜脈注射藥物為生理鹽水，其余操作同模型組。各組造模前7 d灌胃給藥，活血熄風(fēng)方高、中、低劑量組分別給予活血熄風(fēng)方20，10，5 g·kg-1·d-1，對照組給予尼莫地平0.02 g·kg-1·d-1，假手術(shù)組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃。1次/d，末次給藥1 h后造模。2.2 局灶性腦缺血性大鼠模型的制備采用光化學(xué)法誘導(dǎo)制備局灶性腦缺血性大鼠模型，根據(jù)Waston等5的方法略加改動，具體方法如下：室溫25條件下，雄性Wistar大鼠10%水合氯醛(0.35 g·kg-1)麻醉，立體定

11、位儀固定大鼠頭部，常規(guī)消毒后，沿頭正中切口分離至暴露完整的顱骨，以矢狀縫右側(cè)3 mm，冠狀縫后3 mm為中心用牙科平鉆開直徑約6 mm的骨窗，去除顱骨表層骨板，保留下層骨板及硬腦膜，經(jīng)股靜脈緩慢注入5%玫瑰紅80 mg·kg-1，時間為1 min，注射結(jié)束5 min后用冷光源照射骨窗20 min。2.3 TTC染色測腦梗塞灶體積造模后24 h，大鼠麻醉后迅速斷頭取腦，預(yù)冷生理鹽水沖洗殘血，去掉嗅球、小腦和低位腦干，-20冰凍腦組織20 min，在視交叉處冠狀位切腦，其后間隔2 mm連續(xù)做6個冠狀切片，迅速放入2% TTC溶液中，37恒溫孵育20 min，染色后置4%多聚甲醛中固定，正

12、常組織為紅色，缺血區(qū)為白色，24 h后用掃描儀將圖像掃描輸入電腦，采用圖像采集處理系統(tǒng)軟件測量梗塞灶面積，各腦片梗塞面積之和乘以厚度為總的梗塞體積。2.4 RT-PCR法測腦組織VEGF mRNA表達大鼠造模后24 h，麻醉后迅速斷頭取腦，取缺血側(cè)大腦頂葉皮層，液氮速凍后，-70冰箱保存?zhèn)溆谩?.4.1 總RNA 的提取用Trizol常規(guī)方法提取大腦皮層總RNA，紫外分光光度計260280 nm測RNA濃度，1甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量。2.4.2 RT-PCR 反應(yīng)取2 g總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV催化合成cDNA。VEGF mRNA和內(nèi)參照酸性核糖體磷蛋白P0(Acidic r

13、ibosomal protein P0，Arbp)引物由大連寶生物工程有限公司設(shè)計并合成。引物序列如下：VEGF ：5- TGGACCCTGGCTTTACTGCTG -3 （上游），5-GGCAATAGCTGCGCTGGTAGA -3（下游），擴增片段為 127bp；Arbp： 5- GCGTCTGTCTGCAGATTGGCTA -3' (上游)， 5-CAGATGGATCGGCCAGGAA -3(下游)，擴增片段為 150bp。采用50l反應(yīng)體系進行擴增，反應(yīng)參數(shù)為：Arbp95預(yù)變性4 min，94變性30 s，60退火30 s × 30個循環(huán)，72終末延伸4 min。V

14、EGF：954 min，9430 s，6030 s，7220 s×35個循環(huán)； 72終末延伸7 min。2.4.3 半定量分析擴增產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳，在電壓為 5V·cm-1及穩(wěn)流的條件下進行電泳，用Quantity One分析軟件進行光密度掃描，測定各組 PCR 產(chǎn)物密度值與內(nèi)參照Arbp PCR 產(chǎn)物密度值。用各組目的基因片段（VEGF）密度值/內(nèi)參基因片段（Arbp）密度值的比值進行比較。2.5 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，所有數(shù)據(jù)均用±s表示，各組間比較采用單因素方差分析，成組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，以P0.05 為具有統(tǒng)計學(xué)意

15、義。3 結(jié)果3.1 活血熄風(fēng)方對局灶性腦缺血大鼠腦梗塞體積的影響大鼠腦組織經(jīng)TTC染色后，除假手術(shù)組外均在照射區(qū)大腦皮層出現(xiàn)白色梗塞灶，梗塞灶部位恒定，邊界清晰，冠狀面梗塞灶呈“碗形”，尖端指向側(cè)腦室，深達皮質(zhì)全層，表明造模成功?；钛L(fēng)方各劑量組及尼莫地平組腦梗塞灶體積均較模型組減小，統(tǒng)計學(xué)差異顯著(P0.01)?；钛L(fēng)方各劑量組與尼莫地平對照組比較，無明顯差異（P0.05）。結(jié)果見表1，圖1。表1 活血熄風(fēng)方對局灶性腦缺血大鼠腦梗塞體積的影響（略）3.2 活血熄風(fēng)方對局灶性腦缺血大鼠腦組織VEGF mRNA 表達的影響與假手術(shù)組比較，模型組 VEGF mRNA 表達有所升高（P0.01）

16、。與模型組比較，活血熄風(fēng)方各劑量組與尼莫地平組均可顯著上調(diào)腦組織 VEGF mRNA的表達（P0.01），且活血熄風(fēng)方各劑量組 VEGF mRNA 表達相對含量均明顯高于尼莫地平對照組（P0.01）。見表2，圖2。表2 對局灶性腦缺血大鼠腦梗塞邊緣區(qū)VEGF mRNA表達的影響（略）4 討論 在缺血性腦血管疾病的研究中人們注意到，VEGF及其受體的促血管形成作用對缺血半暗區(qū)血供的改善和側(cè)枝循環(huán)的建立具有重要意義。VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞特異性的有絲分裂原，具有促進內(nèi)皮細(xì)胞增殖，提高血管通透性等生物學(xué)特性。腦缺血后，低氧可激活VEGF及其受體系統(tǒng)，促使缺血半暗區(qū)VEGF表達，VEGF誘導(dǎo)大量新生血管形

17、成，促進血管增生，增加受累組織的血流灌注和供氧量，減少神經(jīng)元的凋亡和死亡，減輕腦損傷程度6。 目前發(fā)現(xiàn)VEGF主要有Flkl和Flt兩個特異性受體，其中Flkl是發(fā)揮生物活性的主要受體7，VEGF與其受體結(jié)合后在血管生成和神經(jīng)保護方面發(fā)揮著重要作用8。當(dāng)腦缺血時，VEGF表達增強，并特異性與Flkl 結(jié)合發(fā)揮作用。劉氏等9采用原位雜交方法，結(jié)果顯示，VEGF mRNA主要在缺血半暗區(qū)神經(jīng)元表達，同時在膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞亦有表達。缺血后48 h半暗區(qū)周邊出現(xiàn)血管增生，并逐漸向中心區(qū)延伸，于缺血后7d達高峰，整個缺血半暗區(qū)可見明顯血管增生。 近年來，研究人員開始嘗試?yán)蒙L因子能夠促進血管發(fā)生

18、及生長的原理，治療缺血性血管疾病。目前的治療性血管新生方法中最常用的是外源性促血管生成生長因子的基因治療與重組蛋白質(zhì)治療，但均存在一定限制和困難10，11。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，缺血性中風(fēng)的病機特點是氣血逆亂，“血菀于上”，即淤血不通，腦脈痹阻，因此臨床常采用活血之法，而活血可祛淤，淤血去則新血生，稱之“祛淤生新”。生新不僅是傳統(tǒng)意義上的生新血，應(yīng)當(dāng)還包含有生新絡(luò)的含義，淤血去則新血及新絡(luò)生，生新又反過來促進淤血的祛除，這與治療性血管新生有相同之處。VEGF 是已知作用最強和特異性最高的促血管生長因子，因此也是體現(xiàn)“祛淤生新”的重要指標(biāo)。 本實驗TTC染色發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，光化學(xué)法誘導(dǎo)的局灶性腦缺血

19、模型大鼠大腦皮層出現(xiàn)明顯的梗塞灶（P0.01），同時發(fā)現(xiàn)梗塞區(qū)周圍腦組織VEGF mRNA 表達有所升高（P0.01）。而與模型組相比，活血熄風(fēng)方各劑量組能明顯減少梗塞灶體積（P0.01），同時明顯上調(diào)VEGF mRNA的表達（P0.01），且明顯優(yōu)于尼莫地平對照組（P0.01）。 活血化淤治療腦缺血的一個重要方面是祛淤血生新絡(luò)，本實驗采用具有活血作用的活血熄風(fēng)方，從器官水平上觀察了活血熄風(fēng)方對局灶性腦缺血大鼠腦梗塞體積的影響，從基因水平上觀察了對腦組織VEGF mRNA表達的影響。本實驗結(jié)果顯示，活血熄風(fēng)方可以明顯縮小模型大鼠的腦梗塞體積，具有明顯的腦保護作用，其作用機制可能與增強局灶性腦缺

20、血大鼠梗塞周圍腦組織VEGF mRNA表達，從而促進缺血半暗帶區(qū)的血管新生有關(guān)。【參考文獻】 1Krupinski J,Kaluza J,Kumar P, et al. Role of angiogenesis in patients with cerebral ischemic strokeJ.Stroke,1994,25 (9 ):1794.2金惠銘,李先濤.血管新生的調(diào)控J.中國微循環(huán)雜志,2001,5(2):85.3劉昭純，馬月香，劉紅杰，等 “瘀血生風(fēng)”假說的形成及意義J.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2005，11(3)：88.4高紅莉，劉昭純 活血熄風(fēng)方對局灶性腦缺血模型大鼠的保護作用J

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