四氯化碳大鼠肝纖維化肝細(xì)胞生成白蛋白與膠原的變化及中藥藥物血清的影響_第1頁
四氯化碳大鼠肝纖維化肝細(xì)胞生成白蛋白與膠原的變化及中藥藥物血清的影響_第2頁
四氯化碳大鼠肝纖維化肝細(xì)胞生成白蛋白與膠原的變化及中藥藥物血清的影響_第3頁
全文預(yù)覽已結(jié)束

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

1、    四氯化碳大鼠肝纖維化肝細(xì)胞生成白蛋白與膠原的變化及中藥藥物血清的影響        自四氯化碳肝纖維化大鼠肝臟分離肝細(xì)胞(纖維肝肝細(xì)胞)進(jìn)行體外培養(yǎng),檢測其生成白蛋白與膠原的量,結(jié)合細(xì)胞內(nèi)組織蛋白酶、細(xì)胞外間質(zhì)型膠原酶活性測定,探討肝纖維化肝細(xì)胞膠原生成的變化及相關(guān)機(jī)理,同時(shí)觀察中藥復(fù)方藥物血清對其異常變化的影響。材料與方法1. 材料 Wistar雄性大鼠購自中科院實(shí)驗(yàn)動物中心;體重160180g者分離肝細(xì)胞,250300g者用于制備藥物血清。扶正化瘀方(由丹參、桃仁

2、、蟲草菌絲等組成)由上海中華制藥廠制成流浸膏,每克含生藥8.160g。秋水仙堿為Sevar公司產(chǎn)品。2. 方法 大鼠肝纖維化模型制備方法是首次皮下注射CCl40.5ml,以后每次注射40%CCl4-橄欖油3ml/kg,每周三次,共6周。藥物血清的制備1是在大鼠禁食6小時(shí)后,以10ml/kg(每10ml血清中含0.46g藥物成分,相當(dāng)于成人每千克體重劑量的8倍)灌胃,2小時(shí)后重復(fù)給藥,二次給藥后1小時(shí)于無菌條件下打開腹腔自后腔靜脈采血,分離血清(藥物血清);灌服生理鹽水的大鼠血清為對照;同條件組的血清混勻,56、30min滅活。實(shí)驗(yàn)時(shí)加入培養(yǎng)液制備相應(yīng)濃度的藥物血清溫育液;秋水仙堿以5%對照血清

3、的培養(yǎng)液稀釋,濃度為2.5×107mol/L。3.大鼠肝細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 原位灌流法2分離肝細(xì)胞,以49.2%(v/v)的Ficoll液制備精制的肝細(xì)胞。細(xì)胞用含5%小牛血清(FCS)的199培養(yǎng)液(含胰島素10-9mol/L,地塞米松10-9mol/L)懸浮,接種到培養(yǎng)皿(5×105Cells/ml, 每皿3ml)中。CO2培養(yǎng)箱(5%CO2-95%空氣)內(nèi)培養(yǎng)4小時(shí)后換培養(yǎng)液,此后每24小時(shí)更換一次培養(yǎng)液。培養(yǎng)48小時(shí)后換5%藥物血清-199培養(yǎng)4小時(shí)后換培養(yǎng)液,此后每24小時(shí)更換一次培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后更換無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí),分別收集細(xì)胞與培養(yǎng)液作下一

4、步實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)液中A1b及型膠原含量測定均采用ELISA法。膠原生成率測定3:肝細(xì)胞經(jīng)藥物血清溫育48小時(shí)后更換含L-5-3HPro(5mCi/L)、抗壞血酸和b-氨基丙腈的無血清199液(不含胰島素和地塞米松)溫育24小時(shí);分別收集培養(yǎng)液和細(xì)胞。膠原酶消化法測定細(xì)胞內(nèi)外的膠原生成率。培養(yǎng)液中間質(zhì)型膠原酶活性測定采用3H-醋酐標(biāo)記膠原為底物,凝膠法測定4。肝細(xì)胞組織蛋白酶活性測定;收集細(xì)胞層,加入0.1mol/L乙酸、4,10 000r/min勻漿制備樣品;底物與膠原酶測定同,反應(yīng)系統(tǒng)pH4.0。4.統(tǒng)計(jì)方法 方差分析及雙側(cè)t檢驗(yàn)。結(jié) 果1. CCl4肝纖維化大鼠肝細(xì)胞生成A1b的變化與藥物血清

5、的作用 培養(yǎng)上清液中的A1b量(129.73±4.81mg/L)較正常肝細(xì)胞(150.75±10.97mg/L)顯著降低(P<0.01),藥物血清能顯著提高纖維肝細(xì)胞A1b(168.77±6.64mg/L)的生成量(P<0.001)。2. 纖維肝肝細(xì)胞內(nèi)外膠原生成率及分泌于細(xì)胞外型膠原量的變化及藥物血清的影響 與正常肝細(xì)胞相比,纖維肝肝細(xì)胞內(nèi)外膠原生成率及分泌至細(xì)胞外的型膠原均顯著增加;藥物血清可顯著抑制纖維肝肝細(xì)胞的型膠原的分泌量及細(xì)胞內(nèi)、外的膠原生成率(附表)。3. 纖維肝細(xì)胞組織蛋白酶活性及間質(zhì)型膠原酶活性的變化及藥物血清的影響 與正常肝細(xì)胞(組

6、織蛋白酶活性為0.90±0.12mg,單位為膠原/小時(shí),膠原酶活性為0.50±0.14mg,單位為膠原/小時(shí))相比,纖維肝細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)組織蛋白酶活性(0.60±0.10mg,單位為膠原/小時(shí), P<0.01)及細(xì)胞外的間質(zhì)型膠原酶活性(0.29±0.13mg,單位為膠原/小時(shí), P<0.05)均顯著降低,藥物血清作用后,其活性(分別為0.91±0.13mg膠原/小時(shí); 0.47±0.12mg膠原/小時(shí))顯著提高(P<0.05)。討 論生成白蛋白是肝細(xì)胞特有的功能,正常肝細(xì)胞亦可生成少量的膠原。在CCl4大鼠肝纖維化肝細(xì)

7、胞,其A1b生成量下降了14.0%,而膠原蛋白生成能力卻顯著增強(qiáng),分泌至細(xì)胞外的膠原量增加了3.5倍。表明慢性肝損傷過程中肝細(xì)胞功能的變化在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起著直接的作用。膠原生成量的多寡則取決于其合成和分解代謝的平衡狀態(tài)。各種組織及細(xì)胞系的細(xì)胞內(nèi)新生膠原降解率不同,成纖維細(xì)胞等間葉細(xì)胞為10%20%,而肝細(xì)胞達(dá)30%90%。本文檢測的纖維肝細(xì)胞內(nèi)的組織蛋白酶與細(xì)胞外間質(zhì)型膠原酶活性較正常肝細(xì)胞均顯著降低,提示纖維肝細(xì)胞細(xì)胞外膠原的顯著增加,除了合成因素外,細(xì)胞內(nèi)外膠原降解酶活性的降低可能是其重要因素之一。采用動物經(jīng)口給予中藥后分離的藥物血清能顯著提高細(xì)胞A1b的分泌量;抑制其膠原的生成

8、。表明該藥物血清具有促進(jìn)纖維肝細(xì)胞向正常肝細(xì)胞生理功能轉(zhuǎn)化的作用。另外,組織蛋白酶及間質(zhì)型膠原酶活性的變化尚提示,藥物血清減少纖維肝細(xì)胞膠原生成量的主要機(jī)理是促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)外膠原的降解活性。作者單位:200032上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所參 考 文 獻(xiàn)1 季光,劉平,劉成,等.扶正化瘀方藥物血清對原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞增殖及膠原生成率的影響. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,1997, 3: 20-23.2 劉平,劉乃明,徐列明,等. 丹參乙酸對大鼠肝細(xì)胞增殖及膠原生成的影響. 中華肝臟病雜志,1996, 4: 235-236.3 劉平. 膠原蛋白的實(shí)驗(yàn)方法(譯). 上海:上海中醫(yī)學(xué)院出版社,1992. 199.4

9、 劉平,劉成,徐列明,等. 肝組織中中性膠原酶活性的測定及其在肝纖維化研究中的意義. 中國病理生理雜志, 1989, 4: 566-569.附表四氯化碳肝纖維化大鼠纖維肝肝細(xì)胞膠原生成率的變化及藥物血清的影響(±s) 分組例數(shù)細(xì)胞內(nèi)(%) 細(xì)胞外(%)培養(yǎng)液中型膠原(ng/ml)正常肝細(xì)胞纖維肝細(xì)胞正常肝細(xì)胞纖維肝細(xì)胞正常肝細(xì)胞纖維肝細(xì)胞對照血清50.31±0.090.78±0.08#0.31±0.021.35±0.27#15.17±2.9128.40±1.17#藥物血清50.34±0.050.58±0.02*0.23±0.02#0.70±0.12*10.19±1.74#23.23±2.12*秋水仙堿50.39±0.021.63±0.16*0.02±0.01#0.56±0.15*7.71±1.1120.27±2.61注:與正常肝

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論