以磁納米粒為核的pH敏感型聚谷氨酸樹(shù)狀分子藥物載體

1、第6期2011年6月高分子學(xué)報(bào)ACTA POLYMERICA SINICANo6Jun,2011679*2010-06-08收稿,2010-08-12修稿;國(guó)家自然科學(xué)基金(基金號(hào)50633020,50773046、國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃,項(xiàng)目號(hào)2005CB623903和江蘇省自然科學(xué)基金(基金號(hào)BK2008153資助項(xiàng)目;*通訊聯(lián)系人,E-mail :wuyaoscueducn ;zwguscueducn doi :103724/SPJ1105201110176以磁納米粒為核的pH 敏感型聚谷氨酸樹(shù)狀分子藥物載體*朱榮羅奎徐翔暉吳堯*何斌顧忠偉*(四川大學(xué)國(guó)家生物醫(yī)學(xué)材料工程技

2、術(shù)研究中心成都610064摘要報(bào)道了一種新的肽類樹(shù)枝狀分子改性磁性納米藥物載體以天然氨基酸L-谷氨酸為原料,通過(guò)收斂法合成了聚(L-谷氨酸樹(shù)狀分子,將多巴胺配體鍵合到聚(L-谷氨酸樹(shù)狀分子上,用核磁(1H-NMR 、質(zhì)譜(MS 對(duì)合成出的樹(shù)狀分子配體進(jìn)行了表征,然后通過(guò)配體交換對(duì)四氧化三鐵磁納米粒表面進(jìn)行多功能化以阿霉素為模型藥物通過(guò)pH 敏感的腙鍵與聚(L-谷氨酸樹(shù)狀分子外圍的官能團(tuán)結(jié)合,將藥物負(fù)載到磁納米粒表面構(gòu)建載藥磁納米粒用透射電子顯微鏡(TEM 、動(dòng)態(tài)光散射(DLS 、傅立葉紅外光譜(FTIR 、選區(qū)電子衍射(SEAD 對(duì)納米藥物載體的微觀形貌和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征,研究結(jié)果顯示表面功能化

3、后的磁納米粒在水相中具有很好的分散性和穩(wěn)定性納米載藥粒的平均粒徑為63nm ,載藥量約為52.4mg g 1藥物釋放研究發(fā)現(xiàn),載藥粒具有良好的pH 響應(yīng)性,在pH =7.4時(shí)釋放較慢,而在pH =5.0的微酸性環(huán)境釋放較快體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,樹(shù)狀分子改性后的磁納米粒細(xì)胞毒性較低,而載藥納米粒對(duì)HeLa 細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用這種pH 敏感的聚(L-谷氨酸樹(shù)狀分子改性磁納米粒可作為載體用于藥物傳輸系統(tǒng)關(guān)鍵詞聚(L-谷氨酸樹(shù)狀分子,四氧化三鐵磁納米粒,pH 敏感,藥物傳輸系統(tǒng)超順磁性四氧化三鐵納米粒由于其良好的生物相容性、可生物降解、無(wú)毒性等優(yōu)異的物理特性1,引起了研究者廣泛的關(guān)注作為一種性能

4、優(yōu)異的癌癥診斷和治療的納米生物材料2,四氧化鐵磁納米粒有望發(fā)展成為一類新型的藥物傳輸載體磁納米粒的性質(zhì)如粒徑大小、分布以及磁響應(yīng)值等都與磁納米粒的表面結(jié)構(gòu)和性能密切相關(guān)3通過(guò)磁納米粒的表面功能化,既可使其具有滿足體內(nèi)應(yīng)用所需要的粒徑和水相單分散性,同時(shí)還能將藥物負(fù)載到表面功能化的磁納米粒上,實(shí)現(xiàn)磁靶向納米藥物傳輸系統(tǒng)的構(gòu)建目前,以磁納米粒作為載體的藥物傳輸系統(tǒng)的制備通常采用以下兩種方法:一是用親水性高分子對(duì)磁納米粒表面進(jìn)行修飾,然后將藥物通過(guò)化學(xué)鍵或離子鍵固定到修飾后的磁納米粒表面4;二是用兩親性高分子共聚物或二氧化硅包裹磁納米粒,再將藥物負(fù)載到兩親性高分子形成的膠束或二氧化硅微球中5,6這些

5、方法都在一定程度上增強(qiáng)了磁納米粒在水中的分散性和穩(wěn)定性,但制備的納米粒的粒徑通常超過(guò)150nm 或者更大,在進(jìn)入體內(nèi)時(shí),易被內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)吞噬,難以到達(dá)靶細(xì)胞7高分子化合物或二氧化硅等非磁性物質(zhì)對(duì)磁納米粒的包裹,還會(huì)降低其磁飽和強(qiáng)度,影響磁納米粒的磁響應(yīng)能力為了克服上述問(wèn)題,必須采用新的材料和方法對(duì)磁納米粒表面進(jìn)行功能化利用多巴胺與高溫分解法制備的磁納米粒表面的油酸通過(guò)配體交換進(jìn)行納米粒的表面功能化已成為一種新表面改性策略8,9,然而由于多巴胺分子上功能團(tuán)數(shù)量的限制,要提高改性磁納米粒的載藥量,還要在改性后的磁納米粒表面提供更多的能夠鍵合藥物分子的官能團(tuán)肽類樹(shù)狀大分子是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一類新型的

6、、表面呈現(xiàn)高密度功能團(tuán)的生物醫(yī)用高分子材料,它具有類似蛋白的球狀結(jié)構(gòu)、良好的生物相容性和水溶性并且可生物降解且降解產(chǎn)物無(wú)毒性利用肽類樹(shù)狀分子對(duì)磁納米粒表面進(jìn)行功能化,不僅可以通過(guò)提高樹(shù)狀分子的代數(shù)獲得高的官能團(tuán)密度從而提高載藥量,而且表面功能化后的磁性納米粒的粒徑也可以通過(guò)外圍樹(shù)狀分子的代數(shù)進(jìn)行調(diào)節(jié)10,11,利用肽類樹(shù)狀分子外圍的功能團(tuán)引入pH 敏感的化學(xué)鍵鍵合抗腫瘤藥物,還能實(shí)現(xiàn)藥物在腫瘤部位的智能釋放12本文通過(guò)聚(L-谷氨酸樹(shù)狀分子與多巴胺反應(yīng),利用配體交換策略,將多巴胺與磁性納米粒高分子學(xué)報(bào)2011年表面的油酸進(jìn)行配體交換,制備聚(L-谷氨酸樹(shù)狀分子表面改性的磁性納米粒,將抗腫瘤藥物

7、阿霉素通過(guò)pH敏感的腙鍵與聚(L-谷氨酸樹(shù)狀分子外圍功能團(tuán)偶聯(lián),制備一種既有良好的水相分散性又具有pH敏感的抗腫瘤藥物釋放系統(tǒng),通過(guò)改性納米粒與HeLa細(xì)胞的體外共培養(yǎng),體外評(píng)價(jià)載藥磁納米粒的抗腫瘤效果1實(shí)驗(yàn)部分1.1試劑和儀器叔丁氧基羰基(t-Boc保護(hù)的谷氨酸(分析純,上海吉爾生化公司,多巴胺鹽酸鹽(分析純,Sigma-Aldrich試劑公司,乙酰丙酮鐵(分析純,Sigma-Aldrich試劑公司,阿霉素(DOX,分析純,Sigma-Aldrich試劑公司,鈀/碳催化劑(10%Pd/C,百靈威試劑公司,三氟乙酸(TFA,分析純,成都愛(ài)斯特試劑公司,N-乙基二異丙胺(DIPEA,分析純,成都

8、愛(ài)斯特試劑公司,苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU,分析純,上海吉爾生化公司,1-羥基-苯并-三氮唑(HOBt,分析純,上海吉爾生化公司,二氯甲烷(DCM,N,N-二甲基甲酰胺(DMF,三乙胺(TFA,無(wú)水乙醇等溶劑均需經(jīng)過(guò)干燥、蒸餾等提純后使用核磁共振波譜儀(Mercury Plus400MHz,Varian公司,傅立葉紅外光譜(FTIR,PEspectrometer,透射電子顯微鏡(TEM和選區(qū)電子衍射測(cè)量(SEAD(JEOLJEM-2010F,Japanelectronic公司,動(dòng)態(tài)光散射儀(DLS,MalvernNano-ZS,l=632.8n

9、m,紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-Vis,Lambda650S perkin Elmer1.2聚(L-谷氨酸樹(shù)狀配體的合成N2保護(hù)下,稱取3.747g(9.0mmol化合物2溶解于100mL重蒸的CH2Cl2,在冰浴下加入4.2mL(30mmolDIPEA,攪拌反應(yīng)1h后,加入0.742g(3mmol叔丁氧基羰基(t-Boc保護(hù)的谷氨酸攪拌均勻后,將3.24g(9mmolHBTU和1.22g(9mmolHOBt的混合固體加入反應(yīng)液,在冰浴下攪拌2h,然后升至室溫反應(yīng)48h將反應(yīng)液分別用飽和碳酸氫鈉溶液,5%的硫酸氫鈉和飽和食鹽水洗3次后,用無(wú)水硫酸鎂干燥,過(guò)濾,旋蒸除去溶劑后用CHCl3/EtOA

10、c/CH3CH2OH混合溶劑進(jìn)行柱層析分離得白色固體3,產(chǎn)率75%化合物4的合成參考文獻(xiàn)9,產(chǎn)率63%1H-NMR(400MHz,DMSO,:12.08(s,1H,7.91(t,J= 5.5Hz,1H,7.53 7.27 (m,10H,6.95(m,2H,6.71(m,1H,5.10(d,J=10Hz,4H,3.21(m,2H,2.60 (t,J=7.6Hz,2H,2.41(t,J=6.8Hz, 2H,2.29(t,J= 6.8Hz,2H;13C-NMR(100 MHz,DMSO,:174.1,171.3,148.2,147.2, 138.0,137.9,133.2,128.9,128.0,1

11、21.8, 115.7,115.4,77.6,35.2,30.6,29.1化合物5的合成N2保護(hù)下,稱取1.48g (0.823mmol化合物3溶于0.63mL重蒸的CH2Cl2,冰浴下滴加0.63mL TFA反應(yīng)5h,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷和部分TFA加入30mL無(wú)水Et2O攪拌過(guò)夜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醚得到黃色油狀物將該化合物溶于20mL重蒸的DMF,冰浴下加入1.22mL(7.407mmolDIPEA,攪拌反應(yīng)1h 后,加入0.536g(1.235mmol化合物4攪拌均勻后,將0.468g(1.235mmolHBTU和0.169g (1.235mmolHOBt的混合固體加入反應(yīng)液,將反應(yīng)體系繼續(xù)

12、在冰浴下反應(yīng)2h,然后漸漸升至室溫反應(yīng)48h,將反應(yīng)液分別用飽和碳酸氫鈉溶液, 5%的硫酸氫鈉溶液和飽和食鹽水洗3次,然后用無(wú)水硫酸鎂干燥過(guò)濾,旋蒸除去溶劑后用CHCl3/EtOAc/CH3CH2OH混合溶劑進(jìn)行柱層析分離得淺黃色固體化合物5,產(chǎn)率46%1H-NMR(400MHz,CDCl3,:7.85(d,J=8.5,1H, 7.60 7.20(m,30H,6.88 6.76(m,2H, 6.68(d,J=8.0,1H,5.27 5.00(m,12H, 4.75 4.65(m,2H,4.33 4.27(m,1H, 3.37(m,2H,2.64(t,J=7.2,2H,2.541.82(m,16

13、H;13C-NMR(100MHz,CDCl3,: 173.22,172.96,172.80,172.34,172.33, 171.94,171.90,171.68,148.99,147.61, 137.41,137.30,135.76,135.67,134.99, 134.94,132.32,128.62,128.61,128.57, 128.53,128.49,128.45,128.31,128.25, 128.23,128.18,127.77,127.74,127.36, 127.32,121.61,115.72,115.39,71.43, 71.26,67.71,67.63,66.52,

14、66.42,52.38, 51.72,51.57,40.71,35.08,32.04,31.44, 31.34,30.51,30.29,28.48,26.68,26.6,ESI-TOF-MS:m/z=1181.5282(M+H+(理論值1181.3285化合物6的合成將化合物5(300mg,0.25mmol溶于25mL DMSO中,加入0.1mL NH2-0866期朱榮等:以磁納米粒為核的pH敏感型聚谷氨酸樹(shù)狀分子藥物載體NH2·H2O室溫?cái)嚢?4h后,減壓蒸餾除溶劑,得白色固體6,真空干燥24h產(chǎn)率98%1H-NMR (400MHz,DMSO,:7.60 7.20(m,10H, 6

15、.88 6.76(m,2H,6.68(d,J=8.0,1H, 5.10 5.08(m,4H,4.34 4.04(m,11H, 3.20(m,2H,2.59(m,2H,2.56 1.82(m, 16H;13C-NMR(100MHz,DMSO,:171.32, 170.93,169.70,167.45,158.04,148.16, 146.59,137.43,132.54,131.60,128.32, 127.72,127.56,127.44,115.00,114.62, 106.74,81.57,70.16,70.06,50.97,34.63, 30.52,29.94,27.74ESI-MS:m

16、/z=876.67 (M+(理論值876.961.3磁納米粒的制備超順磁性(Fe3O4用三乙酰丙酮鐵在油酸、高級(jí)脂肪醇和辛基胺存在下,加熱至265,可得到在正己烷中有良好分散性的單晶態(tài)磁納米粒(Fe3O4-OA制備方法參見(jiàn)文獻(xiàn)131.4聚(L-谷氨酸樹(shù)狀分子-改性磁納米粒的制備取200mg(0.22mmol化合物6,用CH3OH 和DMSO的混合溶劑溶解,加入150mg10%的鈀碳,在7.091104Pa H2壓強(qiáng)下反應(yīng)24h過(guò)濾,旋蒸除去溶劑得聚(L-谷氨酸樹(shù)狀大分子配體,取該化合物100mg用甲醇和氯仿的混合溶劑溶解,加入5mL高溫分解法合成的磁納米粒子(10 mg mL1,超聲15min

17、,攪拌24h旋蒸除去部分溶劑,用正己烷洗滌3次蒸餾水分散后,用透析袋(MWCO=8000 14000透析24h,冷凍干燥后備用1.5阿霉素載藥納米粒的制備取10mg樹(shù)狀分子改性磁納米粒用20mL無(wú)水甲醇分散,超聲30min,加入1滴冰乙酸,加入5mg鹽酸阿霉素在室溫下反應(yīng)24h,將反應(yīng)液用透析袋(MWCO=2000透析24h冷凍干燥后備用將透析袋外的溶液定容至1000mL,用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在485nm測(cè)定吸光度,用阿霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算游離的阿霉素濃度載藥磁納米粒的載藥率可根據(jù)如下公式計(jì)算14:載藥率=載體上藥物的質(zhì)量/載體的質(zhì)量100%其中載體上藥物的質(zhì)量可用反應(yīng)總的投藥質(zhì)量減去游離阿霉素的

18、質(zhì)量,可計(jì)算聚(L-谷氨酸樹(shù)狀分子修飾磁性納米載藥粒的載藥量為52.4mg g11.6體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)阿霉素的釋放實(shí)驗(yàn)按下面的方法進(jìn)行分別取10mg阿霉素納米載藥粒子裝在透析袋中封嚴(yán),置于30mL pH為5.0以及7.4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS中,水浴恒溫于37,攪拌速度100 r/min,定時(shí)取樣2mL同時(shí)補(bǔ)加相同體積的擴(kuò)散介質(zhì)用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在485nm測(cè)定吸光度,用PBS阿霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算釋放的阿霉素濃度1.7材料毒性實(shí)驗(yàn)將HeLa細(xì)胞接種于96孔板置于37、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中孵育24h,加入用DMEM溶液稀釋的濃度為6.25、12.5、25、50、100g/m

19、L的聚(L-谷氨酸樹(shù)狀分子改性磁納米粒,各組設(shè)平行樣品3個(gè),以細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞為陰性對(duì)照,培養(yǎng)48h后棄掉培養(yǎng)液,用PBS洗3遍,每孔加入含10%的CCK-8培養(yǎng)液100L,37繼續(xù)孵育2h后用酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀測(cè)定490nm波長(zhǎng)的光密度值(OD,按下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率:存活率%=(實(shí)驗(yàn)組OD490空白組OD490/(對(duì)照組OD490空白組OD490100% 1.8體外載藥磁納米?？鼓[瘤效果評(píng)價(jià)將HeLa細(xì)胞接種于96孔板置后,于37、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h,加入DMEM溶液稀釋的濃度為5、10、15、20、25g mL1的游離阿霉素和載藥磁納米粒,每組3個(gè)平行樣品

20、,以細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞為陰性對(duì)照,培養(yǎng)48h,棄掉培養(yǎng)液后用PBS洗3遍,每孔加入含10%的CCK-8培養(yǎng)液100L,于37孵育2h,用酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀測(cè)定490nm波長(zhǎng)的光密度值(OD,按下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率:存活率%=(實(shí)驗(yàn)組OD490空白組OD490/(對(duì)照組OD490空白組OD490100% 2結(jié)果與討論2.1聚(L-谷氨酸樹(shù)狀分子改性載藥磁納米載藥粒的合成聚(L-谷氨酸樹(shù)狀分子3(示意圖1中的3號(hào)化合物以HBTU/HOBt為縮合試劑通過(guò)常規(guī)多肽縮合反應(yīng)合成(示意圖1,然后在其末端引入多巴胺配體樹(shù)狀大分子外圍保護(hù)的羧基通過(guò)186高分子學(xué)報(bào)2011 年Scheme1Synthetic r

21、oute of glutamic acid based peptide-dendrons and drug loaded nanoparticle與水合肼反應(yīng)得到pH敏感的腙鍵,最后經(jīng)Pd/C 脫多巴胺的羥基保護(hù)得到聚(L-谷氨酸樹(shù)狀分子配體樹(shù)狀分子外圍水合肼的引入是制備pH 敏感藥物載體的關(guān)鍵步驟本文利用酯鍵-酰胺的氨解交換反應(yīng)(ester-amide exchange aminolysis reaction引入水合肼從1H-NMR譜圖(圖1分析可以發(fā)現(xiàn)化學(xué)位移在5.2 5.0之間的氫質(zhì)子信號(hào)峰,在未進(jìn)行氨解交換反應(yīng)前,為6個(gè)單峰,分別對(duì)應(yīng)聚(L-谷氨酸樹(shù)狀分子外圍的4個(gè)芐脂保護(hù)基中的CH2

22、以及多巴胺2個(gè)羥基芐醚保護(hù)基的CH2;而反應(yīng)后,峰的數(shù)目減少至2個(gè)單峰(對(duì)應(yīng)多巴胺2個(gè)羥基芐醚保護(hù)基的CH2說(shuō)明保護(hù)的羧基已經(jīng)轉(zhuǎn)換為通過(guò)酰胺鍵連接的水合肼從峰積分面積的分析也證明了相同的結(jié)論:水合肼已接到了樹(shù)狀分子的外圍聚(L-谷氨酸樹(shù)狀分子改性磁納米粒的制備通過(guò)配體交換法完成配體交換法是一類能夠通過(guò)交換納米粒表面配體類型從而實(shí)現(xiàn)改變納米2866期朱榮等:以磁納米粒為核的pH 敏感型聚谷氨酸樹(shù)狀分子藥物載體Fig11H-NMR spectra of compound5and6粒子表面性質(zhì)的經(jīng)典方法15在制備單分散的超順磁性納米微球的多種方法中,高溫分解法在磁性納米粒的粒徑及其分布、結(jié)晶度等方面

23、都較其他方法更有優(yōu)勢(shì)13這種方法制備的磁性納米粒只能分散于正己烷等非極性溶劑,極大地限制了其在生物醫(yī)學(xué)中的運(yùn)用研究發(fā)現(xiàn),多巴胺能夠取代磁性納米粒表面油酸配體且能夠與四氧化三鐵形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵8,16本文選擇多巴胺作為連接磁性納米粒和聚(L-谷氨酸樹(shù)狀分子的連接分子,通過(guò)配體交換反應(yīng),成功制備出能夠在水相體系有良好分散的超順磁性納米粒2.2聚(L-谷氨酸樹(shù)狀分子改性載藥磁納米粒的表征為進(jìn)一步證明聚(L-谷氨酸樹(shù)狀分子通過(guò)配體交換反應(yīng)對(duì)磁納米粒的成功修飾,我們對(duì)制備的磁納米粒進(jìn)行了傅立葉紅外光譜(FTIR的測(cè)定圖譜分析表明,用高溫分解法制備的磁納米粒(圖2(a在2922和2852cm1處有強(qiáng)吸收峰

24、,此處的吸收峰為磁納米粒表面油酸的CH2伸縮振動(dòng)峰,1543和1407cm1處出現(xiàn)C O 的吸收峰也進(jìn)一步證明了表面油酸配體的存在位于585cm1的吸收峰則為FeO的特征吸收峰17在進(jìn)行了聚(L-谷氨酸樹(shù)狀大分子配體交換以后,紅外譜圖上出現(xiàn)了聚(L-谷氨酸樹(shù)狀分子的特征峰,其分別為:3100 3300cm1出現(xiàn)的較寬的吸收峰為樹(shù)狀分子中酰胺鍵(NH以及外圍的水合肼(NH的伸縮振動(dòng)吸收;1650和1540cm1處的吸收峰則對(duì)應(yīng)樹(shù)狀分子中酰胺羰基的吸收譜帶1180cm1處的吸收峰則對(duì)應(yīng)CN的伸縮振動(dòng)峰同樣,在590cm1處強(qiáng)的吸收振動(dòng)峰為FeO的特征吸收峰這些結(jié)果都表明通過(guò)多巴胺的連接,聚(L-谷

25、氨酸樹(shù)狀分子經(jīng)配體交換將原磁性納米粒表面的油酸置換下來(lái)載藥納米粒子的FTIR圖譜如圖2(c所示,阿霉素在1260,1112,1070,1026,1004,989和968cm1出現(xiàn)其特征吸收峰181260cm1處的吸收峰對(duì)應(yīng)阿霉素分子中的COCH3特征峰19,表明阿霉素已經(jīng)通過(guò)共價(jià)鍵與磁納米粒連接到一起而其它位置的吸收峰則和未接阿霉素的磁納米粒的紅外譜圖類似,分析原因可能為阿霉素特征峰主要出現(xiàn)在900 1100cm1范圍內(nèi),但此范圍內(nèi)各種特征峰又相互重疊在一起,所以較難分辨此外,也有可能是磁納米粒上結(jié)合阿霉素的量較少而出現(xiàn)的吸收峰較弱,被該范圍內(nèi)強(qiáng)的吸收峰所掩蓋 Fig2FTIR spectra

26、 of the nanoparticles:(aFe3O4-OA,(bFe3O4-G2(Glu-CONHNH2,(cFe3O4-G2(Glu-DOX and(dDOX如前所述,粒徑大小、分布以及其在水相分散的穩(wěn)定性是設(shè)計(jì)磁性納米藥物載體所必須考慮的重要因素研究表明,只有粒徑在10 100nm的載藥納米粒子子才最適合通過(guò)靜脈注射方式給藥7用透射電子顯微鏡對(duì)聚(L-谷氨酸樹(shù)狀分子改性磁納米粒的形貌及粒徑表征的結(jié)果顯示,通過(guò)配體交換反應(yīng)制備出的磁納米粒和鍵合了阿霉素的載藥粒子在水中都有非常好的分散性和穩(wěn)定性(存放一個(gè)月以上也無(wú)明顯聚集從圖3中可以看到,納米粒為規(guī)則的球形,尺寸比較均勻,粒子直徑都在1

27、0nm左右雖然透射電子顯微鏡提供了較為直觀的磁納米粒的形貌信息,但磁納米粒表面的聚(L-谷氨酸樹(shù)狀分子通常在TEM 觀測(cè)下是透明的20,而利用動(dòng)態(tài)光散射儀(DLS測(cè)定的載藥磁納米粒在水相中的粒徑增加至63386684 高 分 子 學(xué) 報(bào) 2011 年 nm （ 圖 4 ） ， 這也從 一 定 程 度 上 證 明 了 經(jīng) 過(guò) 配 體 交 谷氨酸樹(shù)狀分子已經(jīng)鍵連到磁納米粒表面 換， Fig 5 Selected area electron diffraction （ SAED ） pattern acquired from Fe 3 O 4 -G2 （ Glu ） -CONHNH 2 nanopa

28、rticle Table 1 Measured lattice spacing ，d （ nm ） ，based on the rings in Fig 5 band standard atomic spacing for Fe 3 O 4 along with their respective hkl indexes from the PDF database Ring 1 d Fe 3 O 4 hkl Typical TEM images of Fe 3 O 4 -G2 （ Glu ） 0. 487 0. 486 111 2 0. 298 0. 297 220 3 0. 252 0. 25

29、3 311 4 0. 212 0. 21 400 5 0. 173 0. 171 422 6 0. 162 0. 162 511 7 0. 149 0. 148 440 Fig 3 18 h 內(nèi)的累積釋放率高達(dá) 快 pH = 5. 0 的介質(zhì)中， 70% ；而 在 pH = 7. 4 的 介 質(zhì) 中， 18 h 內(nèi) 的 累 積 釋 放率僅為 40% 這種釋放 速 率 的 差 異 是 因 為 阿 霉 素和載藥磁納米粒間形成的 C 時(shí)水解速率 的 不 同 造 成 的 效 22 21 CONHNH 2 （ a ） and Fe 3 O 4 -G2 （ Glu ） -DOX （ b ） N 鍵在不同

30、pH pH 值 響 應(yīng) 的 藥 物 釋放系統(tǒng) 已 經(jīng) 被 證 明 對(duì) 癌 癥 治 療 具 有 很 好 的 療 ， 載藥磁納米粒在 pH = 7. 4 環(huán)境中的緩慢釋 6. 5 ， 藥物會(huì)加 能夠極大地降低藥物對(duì)正常組織的副作用 進(jìn) 放， 內(nèi)涵體的 pH 值為 4. 5 入細(xì)胞后， 速釋放， 從而提高治療效果 Fig 4 Particle size histograms by DLS of Fe 3 O 4 -G2 （ Glu ） -DOX 磁納米粒的晶 體 結(jié) 構(gòu) 決 定 了 其 磁 性 特 征， 為 了證明在 經(jīng) 過(guò) 聚 （ L-谷 氨 酸 ） 樹(shù) 狀 大 分 子 配 體 交 換前后， 磁性

31、核 Fe 3 O 4 的晶體結(jié)構(gòu)沒(méi)有改變， 用選 區(qū)電子衍射（ 圖 5 ） 對(duì)配體交換后的粒子晶體結(jié)構(gòu) 進(jìn)行 了 表 征， 通過(guò)電子衍射環(huán)計(jì)算的數(shù)值與 Fe 3 O 4 標(biāo)準(zhǔn)晶面間距能很好的吻合13 表 1 總結(jié)了所測(cè)量的衍射環(huán)所體現(xiàn)出的晶面 間距以及其所對(duì)應(yīng)的晶面指標(biāo) hkl 2. 3 體外藥物釋放 載藥磁納 米 粒 的 體 外 藥 物 釋 放 在 PBS 中 進(jìn) 行 從圖 6 可觀 察 到 藥 物 釋 放 的 速 率 在 微 酸 性 環(huán) 境 pH = 5. 0 顯然 要 比 正 常 生 理 環(huán) 境 pH = 7. 4 要 2. 4 細(xì)胞毒性 將聚（ L-谷 氨 酸 ） 樹(shù) 狀 分 子 改

32、性 磁 納 米 粒 與 HeLa 細(xì)胞孵育 48 h 評(píng)價(jià)其細(xì)胞毒性 結(jié)果如圖 7 Fig 6 in PBS Release profiles of DOX from Fe 3 O 4 -G2 （ Glu ） -DOX 6期 朱榮等：以磁納米粒為核的 pH 敏感型聚谷氨酸樹(shù)狀分子藥物載體 685 所示， 改性磁納米 粒 的 細(xì) 胞 毒 性 隨 著 濃 度 的 增 加 在 6. 3 略有增加， 100 g / mL 間 5 個(gè)不同磁納米 粒濃度下的 細(xì) 胞 存 活 率 均 高 于 90% ， 說(shuō) 明 聚 （ L谷氨酸） 樹(shù)狀大分 子 改 性 磁 納 米 粒 的 細(xì) 胞 毒 性 很 有作為藥物載體

33、的潛力 低， Fig 8 The cytotoxicity of free DOX ， Fe 3 O 4 -G2 （ Glu ） - DOX ，against HeLa cells after 24 and 48 h incubation 15 ， 20 ，25 g / mL for each DOX concentrations were 5 ，10 ， group Fig 7 Cytotoxicity of Fe 3 O 4 -G2 （ Glu ） -CONHNH 2 原因可推測(cè)為存 在 一 個(gè) 阿 霉 素 的 有 效 治 療 濃 度， 即當(dāng)細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度達(dá)到這一濃度就足以抑制 細(xì)胞的增

34、殖 2. 5 體外抗腫瘤效果 圖 8 為載藥 磁 納 米 粒 的 體 外 抗 腫 瘤 效 果 研 究結(jié) 果 顯 示， 孵 育 24 h 后， 游離阿霉素和載藥磁 納米粒在相同的 藥 物 濃 度 下， 都表現(xiàn)出一定的抗 50% 以上的腫瘤細(xì)胞都被殺死， 但游離 腫瘤效果， 阿霉素的抗腫瘤效果好 于 載 藥 磁 納 米 粒；孵 育 48 h 后， HeLa 細(xì) 胞 的 存 活 率 僅 為 10% 15% ， 載藥 磁納米粒與游離 阿 霉 素 的 抗 腫 瘤 效 果 接 近 負(fù) 載 從 在磁納米粒上的 阿 霉 素 通 過(guò) 腙 鍵 的 水 解 斷 裂， 磁納米粒載體上 釋 放 出 來(lái)， 起到了抑制腫瘤

35、細(xì)胞 增殖的作用 細(xì)胞 存 活 率 并 沒(méi) 有 表 現(xiàn) 出 隨 藥 物 濃 度增加而出現(xiàn)較為明顯的下降趨勢(shì) 當(dāng)阿 霉 素 濃 度 超 過(guò) 10 g / mL （ 15 25 g / mL ） 時(shí)， HeLa 細(xì) 胞 的 存 活 率 的 變 化 趨 勢(shì) 不 明 顯， 3 結(jié)論 通過(guò)配體 交 換 法 用 聚 （ L-谷 氨 酸 ） 肽 類 樹(shù) 狀 分子對(duì)磁納米粒 進(jìn) 行 表 面 功 能 化， 并將抗腫瘤藥 物阿霉素通 過(guò) pH 敏 感 的 化 學(xué) 鍵 偶 聯(lián) 到 聚 （ L-谷 氨酸） 樹(shù)狀大分子 的 外 圍 官 能 團(tuán) 獲 得 了 載 藥 磁 性 納米粒 表面功能 化 后 的 磁 性 納 米 粒

36、 在 水 中 具 有 良好的分散性和穩(wěn)定性 藥物釋放研究結(jié)果表明， 藥物與磁性 納 米 粒 載 體 間 pH 敏 感 鍵 的 引 入， 可 以實(shí)現(xiàn)藥物的智能 釋 放 聚 （ L-谷 氨 酸 ） 肽 類 樹(shù) 狀 分子改性磁納米 粒 的 細(xì) 胞 毒 性 較 低， 載藥磁納米 粒對(duì) HeLa 細(xì)胞表現(xiàn) 出 很 好 的 體 外 抑 制 腫 瘤 細(xì) 胞 增殖效果 REFERENCES 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Mahmoudi M ， Simchi A ， Milani A S ， Stroeve P J Colloid Interf Sci ， 2009 ， 336 （ 2 ）

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