愈創(chuàng)木酚比色法測(cè)定過(guò)氧化氫酶活性

1、 1 / 4 過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定（愈創(chuàng)木酚比色法） 原理 過(guò)氧化物酶廣泛分布于植物的各個(gè)組織器官中。在有過(guò)氧化氫存在下，過(guò)氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色物質(zhì)，可用分光光度計(jì)測(cè)量生成物的含量。 儀器藥品 721型分光光度計(jì)離心機(jī) 秒表天平 研缽磁力攪拌器 愈創(chuàng)木酚30%過(guò)氧化氫 20mmol/L KH 2PO4100mmol/L磷酸緩沖液，pH6.0（見(jiàn)附表2） 反應(yīng)混合液：100mmol/L磷酸緩沖液(pH6.0)50ml于燒杯中，加入愈創(chuàng)木酚28l，于磁力攪拌器上加熱攪拌，直至愈創(chuàng)木酚溶解，待溶液冷卻后，加入30%過(guò)氧化氫19l，混合均勻，保存于冰箱中。 操作步驟 1稱取植物材料1g

2、，加20mmol/L KH 2PO 45ml，于研缽中研磨成勻漿，以4000r/min離心15分鐘，傾出上清液保存在冷處，殘?jiān)儆?mlKH 2PO 4溶液提取一次，合并兩次上清液，貯于冷處備用。 2 / 4 2取光徑1cm比色杯2只，于1只中加入反應(yīng)混合液3ml，KH 2PO 41ml，作為校零對(duì)照，另1只中加入反應(yīng)混合液3ml，上述酶液1ml（如酶活性過(guò)高可稀釋之），立即開(kāi)啟秒表記錄時(shí)間，于分光光度計(jì)上測(cè)量吸光度值，每隔1分鐘讀數(shù)一次，讀數(shù)于波長(zhǎng)470nm下進(jìn)行。 3以每分鐘吸光度變化值表示酶活性大小，即以A470/min·mg蛋白質(zhì)（或鮮重g）表示 實(shí)驗(yàn)三十八過(guò)氧化物酶活性的測(cè)

3、定（比色法） 過(guò)氧化物酶是植物體內(nèi)普遍存在的、活性較高的一種酶，它與呼吸作用、光合作用及生長(zhǎng)素的氧化等都有密切關(guān)系，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，它的活性不斷發(fā)生變化，因此測(cè)量這種酶，可以反映某一時(shí)期植物體內(nèi)代謝的變化。 在有過(guò)氧化氫存在的條件下，過(guò)氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色物質(zhì)，該物質(zhì)在470nm 處有最大吸收，可用分光光度計(jì)測(cè)量470 nm處的吸光度變化速率來(lái)測(cè)定過(guò)氧化物酶活性。 一、儀器、藥品與材料 （一）實(shí)驗(yàn)材料 xx植物組織。 （二）儀器與用品 分光光度計(jì)，研缽，恒溫水浴鍋，100 mL容量瓶，吸管，高速冷凍離心機(jī)，秒表，磁力攪拌器。 （三）試劑 愈創(chuàng)木酚。 30過(guò)氧化氫。 3 /

4、 4 100 mmol/L磷酸緩沖液pH 6.0（見(jiàn)附錄7）。 反應(yīng)混合液： 取100 mmol/L磷酸緩沖液（pH 6.0）50 mL于燒杯中，加入愈創(chuàng)木酚28L，于磁力攪拌器上加熱攪拌，直至愈創(chuàng)木酚溶解，待溶液冷卻后，加入30 %過(guò)氧化氫19L，混合均勻，保存于冰箱中備用。 二、實(shí)驗(yàn)步驟 1稱取植物材料0.1 g，剪碎，放入研缽中，加入適量的磷酸緩沖液研磨成勻漿，殘?jiān)儆? mL磷酸緩沖液提取一次，以4000 rpm低溫離心15 min，上清液即為粗酶液，定容至10mL刻度，貯于低溫下備用。 2取2支試管，于1只中加入反應(yīng)混合液3 mL和磷酸緩沖液1mL，作為對(duì)照，另1支中加入反應(yīng)混合液3

5、 mL和上述酶液1mL（如酶活性過(guò)高可稀釋之）。迅速將兩支試管中溶液混勻后，倒入比色杯，置于分光光度計(jì)樣品室內(nèi)，立即開(kāi)啟秒表記錄時(shí)間，于470 nm處測(cè)定吸光度（OD）值，每隔10S讀數(shù)一次。 3結(jié)果計(jì)算： 以每分鐘OD變化值（A470 / gFW min）表示酶活性大小，。也可以用每min OD值變化0.01作為1個(gè)過(guò)氧化物酶活性單位（U）表示。 過(guò)氧化物酶活性（U/gFW·min）=A470×VT/W×VS×0.01×t 式中： A470反應(yīng)時(shí)間內(nèi)OD變化值。 VT 提取酶液總體積（mL）。 W 植物鮮重（g）。 Vs 測(cè)定時(shí)取用酶液體積（mL）。 t 反應(yīng)時(shí)間（min）。 4 / 4 三、思考題 測(cè)定過(guò)氧化物酶活性除了本方法外，還可以采用什么方法進(jìn)行