實(shí)驗(yàn)七 核酸序列分析(附加部分)

1、實(shí)驗(yàn)七 核酸序列分析（附加部分）1、 發(fā)現(xiàn)核酸序列中的蛋白質(zhì)編碼區(qū)域。1） 利用NCBI ORF Finder。 A、 在NCBI上查找AC號(hào)為AE008569的核酸記錄，思考：1、這個(gè)序列的名稱？2、這個(gè)序列所屬的生物學(xué)分類？B、 進(jìn)入OFR Finder，首先在頁(yè)面下方的Genetic codes 下拉菜單中瀏覽現(xiàn)有的22種遺傳密碼選擇項(xiàng)（這里我們只使用默認(rèn)的standard code），利用AC號(hào)或其裸序列（想一想怎么能得到）進(jìn)行ORF finding。C、 在結(jié)果顯示頁(yè)面中，按照序列的正向+1、+2、+3以及反向的-1、-2、-3進(jìn)行的六框翻譯結(jié)果以圖形的方式顯示在頁(yè)面中。利用默認(rèn)的1

2、00bp閾值所發(fā)現(xiàn)的各框內(nèi)的ORF以綠色條狀顯示。同時(shí)，按照六框內(nèi)所有發(fā)現(xiàn)的ORF的大小順序，在頁(yè)面的右側(cè)有一個(gè)列表，分別顯示了ORF的翻譯框、在基因組上的位置以及ORF的長(zhǎng)度。你可以改變ORF鑒別中的長(zhǎng)度閾值（50，100，300），點(diǎn)擊Redraw重新進(jìn)行計(jì)算。D、 點(diǎn)擊圖形上的綠色條框，就可以對(duì)這個(gè)ORF進(jìn)行檢查（當(dāng)然也可以點(diǎn)擊右側(cè)的ORF列表），頁(yè)面上會(huì)顯示預(yù)測(cè)的氨基酸序列，同時(shí)頁(yè)面上還嵌入了BLAST程序以及NCBI的有關(guān)序列數(shù)據(jù)庫(kù)以便于發(fā)現(xiàn)與此ORF相似的庫(kù)記錄。非常方便！E、 SixFrames是以另外一種方法計(jì)算并顯示結(jié)果，點(diǎn)擊SixFrames，結(jié)果中各框上邊拉下的綠色短線表

3、示為一個(gè)起始密碼子，而各框下方的粉色短線表示為一個(gè)終止密碼子。F、 如果你擁有一個(gè)高等生物的cDNA時(shí)，可以利用ORF finder這個(gè)簡(jiǎn)單的工具來(lái)找到你的蛋白編碼區(qū)域。因?yàn)閏DNA不含有intron，因此可擁有與微生物相似的ORF結(jié)構(gòu)。G、 ORF finder可以正確地鑒定85%左右的蛋白編碼區(qū)，但要發(fā)現(xiàn)一些很短的蛋白序列，shadow gene或使用了非常用遺傳密碼子的基因，則需要使用那些包含了密碼子使用頻率及使用偏好等統(tǒng)計(jì)學(xué)特性的程序，如GeneMark。這里給出兩個(gè)GeneMark網(wǎng)址： , 。2） 發(fā)現(xiàn)真核生物基因組（如脊椎動(dòng)物）序列中的蛋白質(zhì)編碼區(qū)域。A、 剪切位點(diǎn)（splice

4、 site）的預(yù)測(cè)。脊椎動(dòng)物的外顯子很?。ㄆ骄?50bp），它們的剪切位點(diǎn)還有一定的變化。因此發(fā)現(xiàn)外顯子要比利用ORF finder或GeneMark發(fā)現(xiàn)ORF困難得多。下面是一種外顯子預(yù)測(cè)程序：MZEF。點(diǎn)擊/ ，這是位于冷泉港實(shí)驗(yàn)室Michae Q. Zhangs的主頁(yè)，點(diǎn)擊左側(cè)的databases and Software Tools，進(jìn)入的頁(yè)面中包含了多個(gè)物種的啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫(kù)、外顯子發(fā)現(xiàn)工具等，點(diǎn)擊頁(yè)面中間的Gene Finding (public)連接，則進(jìn)入了MZEF頁(yè)面（ ）。程序的相關(guān)說(shuō)明文件在頁(yè)面下方的 For more information about MZE

5、F行的here鏈接中，事先閱讀一下此文件，有助于程序的使用以及對(duì)輸出結(jié)果的理解( )，你也可以閱讀實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)-實(shí)驗(yàn)七中的MZEFexample.PDF文件，這一文件也可以從Michae Q. Zhangs的數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件工具頁(yè)面上找到(）?；氐組ZEF主頁(yè)，點(diǎn)擊Human 鏈接（finder/human.htm ），進(jìn)入由先前統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)校準(zhǔn)的人類編碼外顯子預(yù)測(cè)MZEF程序頁(yè)面。在NCBI上找到一條AC號(hào)為AF018429的人類核酸記錄，這是一個(gè)包含了外顯子1和外顯子2的dUTPase基因（注意一下這兩個(gè)外顯子在基因上的位置）。將FASTA格式的序列粘貼到人類MZEF程序頁(yè)面的檢索框中，點(diǎn)擊submi

6、t。程序很快給你返回結(jié)果。它發(fā)現(xiàn)了在1056-1172間的一個(gè)外顯子（通過(guò)幫助文件理解結(jié)果中各項(xiàng)的含義）。預(yù)測(cè)的正確性有1/2（漏掉了一個(gè)exon）。而且，預(yù)測(cè)到的外顯子的真實(shí)起始位點(diǎn)也不在1056。這樣的正確率（1/2，不完全吻合）在外顯子發(fā)現(xiàn)程序中并不少見(jiàn)。下面兩個(gè)網(wǎng)址則將MZEF與其它的方法綜合在一起進(jìn)行外顯子預(yù)測(cè)：EBI的MZEF-SPC （）以及Michigan Tech的AAT（ ）。B、 真核生物基因組的完全基因分析如果你在進(jìn)行基因組測(cè)序，那么所需要的就是那些最高水平的復(fù)雜的計(jì)算機(jī)輔助注釋工具：基因組剖析軟件（genome-parsing software）。這些軟件程序是為一次

7、處理一個(gè)基因組的大片段序列（10萬(wàn)到幾百萬(wàn)bp）的注釋而設(shè)計(jì)的，它們對(duì)序列中所有基因的具體外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。與MZEF類似，這些程序也有數(shù)模結(jié)構(gòu)（modular structure），每一個(gè)數(shù)模都為識(shí)別一個(gè)特定的基因組分（如編碼外顯子，第一個(gè)/最后一個(gè)外顯子，啟動(dòng)子區(qū)域，多聚腺苷酸化位點(diǎn)等）而設(shè)計(jì)。這些相對(duì)獨(dú)立的數(shù)模所產(chǎn)生的結(jié)果被拼合成連續(xù)的基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（比如將預(yù)測(cè)的外顯子區(qū)域邊界粘接形成閱讀框）。這些預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)最后會(huì)根據(jù)與理想基因模型的相似度大小而進(jìn)行記分。馬可夫模型（Markov Models）以及動(dòng)態(tài)規(guī)化優(yōu)化是這些程序的基礎(chǔ)核心概念。大多數(shù)的基因組剖析軟件（比如我們下面要用到的G

8、enomeScan）也考慮了蛋白質(zhì)序列的相似性。（注意：并不是所有的外顯子都可被發(fā)現(xiàn)！大多數(shù)的外顯子預(yù)測(cè)程序只限于內(nèi)部外顯子，而那些與5或3不翻譯的轉(zhuǎn)錄區(qū)域(UTR) 相連的編碼外顯子，比如第一或最后一個(gè)密碼子，通常不會(huì)被程序發(fā)現(xiàn)。）盡管這些程序的算法越來(lái)越復(fù)雜，但使用起來(lái)卻很容易。你只要將序列粘貼到輸入窗口，點(diǎn)擊個(gè)執(zhí)行鍵，就可以得到剖析后的基因了！現(xiàn)在我們就利用GenomeScan 剖析軟件程序進(jìn)行一個(gè)大于100000bp（且至少包含有一個(gè)完整的基因）的人類基因組序列大片段上的基因進(jìn)行預(yù)測(cè)（我們使用的是GenomeScan站點(diǎn)上的示范DNA序列）。同時(shí)，我們還需要那些與你的DNA序列所預(yù)測(cè)的

9、編碼區(qū)域有顯著相似性的蛋白質(zhì)序列。這些蛋白質(zhì)序列可通過(guò)將你的序列對(duì)已知的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blastx而得到。（當(dāng)然，我們這里使用的還是GenomeScan站點(diǎn)上的示范蛋白質(zhì)序列。注意，不論蛋白質(zhì)序列還是DNA序列都要以FASTA格式進(jìn)行比較。）進(jìn)入GenomeScan主頁(yè)（），點(diǎn)擊GenomeScan WebServer，從物種選擇下拉菜單中選擇Vertebrate（即選擇由相應(yīng)物種的編碼區(qū)域統(tǒng)計(jì)值進(jìn)行校正后的程序進(jìn)行預(yù)測(cè)），將DNA testfile的序列（FASTA格式）粘在DNA Sequence input box中，將protein file中的蛋白序列（FASTA格式）粘在Pr

10、otein Sequence input box中，點(diǎn)擊Run GenomeScan。輸出的結(jié)果是一個(gè)非常長(zhǎng)的列表，列出了每一個(gè)預(yù)測(cè)基因的所有組成成分，它們所在的位置以及相關(guān)的質(zhì)量評(píng)估值。在進(jìn)行大規(guī)模的測(cè)序項(xiàng)目及自動(dòng)注釋這一連續(xù)的過(guò)程中，這一結(jié)果是計(jì)算機(jī)程序所必需的。好在GenomeScan同時(shí)也提供了非常好的圖形輸出結(jié)果，這一圖形結(jié)果以PDF及PostScript圖像形式保存。在本例分析所得到的圖中，預(yù)測(cè)的基因及外顯子以紅色箭頭及紅色方塊表示，而通過(guò)blastx相似性所得到的蛋白質(zhì)支持證據(jù)則以綠色方塊表示。在這條100000bp的脊椎動(dòng)物基因組長(zhǎng)序列中，總共包含了5個(gè)預(yù)測(cè)基因。2、 序列片段

11、的拼裝（assembling）目前的測(cè)序機(jī)器一次只能產(chǎn)生500到1000bp的核苷酸序列，因此只要你的序列比較長(zhǎng)，就可能需要將短的重疊片段進(jìn)行拼裝。當(dāng)進(jìn)行大規(guī)模的測(cè)序項(xiàng)目時(shí)，以一個(gè)典型的的微生物基因組為例，得到其4MB的基因組序列就需要對(duì)超過(guò)50000條測(cè)序小片段（我們稱之為reads）進(jìn)行縫合。這些基因組測(cè)序項(xiàng)目所使用的組裝軟件的數(shù)據(jù)直接來(lái)源于測(cè)序機(jī)器所產(chǎn)生的色譜圖（chromatograms or traces）。色譜圖即是由復(fù)雜的峰值及谷值熒光值所組成的，它揭示了測(cè)序小片段中每一個(gè)位置的核苷順序。這些程序中還包含了能夠計(jì)算每一個(gè)測(cè)序片段每一個(gè)位置每一個(gè)核苷的質(zhì)量記分的堿基讀取系統(tǒng)（bas

12、e-calling system），數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)以及交互式的編輯與顯示工具。這些復(fù)雜的完整基因組測(cè)序軟件包不能通過(guò)網(wǎng)絡(luò)提供服務(wù)，你必須把它們下載到本地并安裝到專門的高性能計(jì)算機(jī)上使用。常用的公共測(cè)序軟件包有 Staden pakage, Phred/Phrap等。即使不做這些基因組測(cè)序項(xiàng)目，日常工作中一樣會(huì)遇到序列拼裝的問(wèn)題。比如，你的cDNA包含在多個(gè)PCR片段中，或者你有一些表達(dá)序列標(biāo)簽（EST），想知道能否由這些EST推導(dǎo)出一條完整的cDNA。或者你想用從數(shù)據(jù)庫(kù)中提取的EST序列進(jìn)行拼裝等等。這時(shí)你就會(huì)希望利用一個(gè)簡(jiǎn)單的能夠識(shí)別出你的序列集中顯著的重疊區(qū)并將它們拼裝成一條序列（我們稱之為contig）。下面我們利用IFOM（FIRC Institute of Molecular Oncology in Milano）的EST assembler進(jìn)行序列的拼裝。點(diǎn)擊http:/bio.ifom-firc.it/ASSEMBLY/assemble.html ，將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)-實(shí)驗(yàn)七中的EST assembling文件上載到服務(wù)器的文件輸入框中或?qū)⑵渲械男蛄衅渭訤ASTA格式粘到序列輸入框中。（注意，不需要考慮提供序列的方向性問(wèn)題，因?yàn)槌绦驎?huì)自動(dòng)在兩個(gè)方向上進(jìn)行查找）。針對(duì)不同的情況，可對(duì)頁(yè)面下部的一些參數(shù)進(jìn)行修改，比如最