液相色譜泊聯(lián)質(zhì)譜法測定兔血漿中葛根素的濃度

1、液相色譜?泊?聯(lián)質(zhì)譜法測定兔血漿中葛根素的濃度【摘要】 目的 建立測定兔血漿中葛根素濃度的液相色譜?泊?聯(lián)質(zhì)譜法。方法 血漿加入內(nèi)標橙皮苷后經(jīng)固相萃取處理，采用Aglient C18柱（150 mm2.1 mm，3.5 m）分離，流動相為甲醇?10 mmol?L-1醋酸銨緩沖液?慘譯媯寤?比702010），流速為0.2 mL?min-1。樣品在串聯(lián)質(zhì)譜中經(jīng)ESI源離子化后以多反應(yīng)離子監(jiān)測方式測定。結(jié)果 葛根素在103 000 ng?mL-1線性良好(r=0.9986)，檢測限為10 ng?mL-1，回收率為99.91%103.92%，絕對回收率為91.33%100.40%，日內(nèi)、日間變異（RS

2、D）均15%，色譜峰保留時間為1.67 min。結(jié)論 方法靈敏、準確、快速、特異性強，適用于中藥葛根素的藥動學研究。 【關(guān)鍵詞】 液相色譜?倉勢追桓鷥?素；血藥濃度Abstract:Objective To establish an HPLC?MS?MS method for determining the content of plasma puerarin. Methods The plasma sample pretreated with solid?phase extraction after addition of internal standard of hesperidin wa

3、s analyzed on an Aglient C18 column（150 mm2.1 mm，3.5 m）. The mobile phase consisted of methanol?10 mmol?L-1 NH4AC buffer?acetonitrile（702010） with the flow rate of 0.2 mL?min-1. The sample was ionized by electrospray ionization source in the triple quadruple tandem mass spectrometer，then, it was qua

4、ntitated with multiple reaction monitoring mode. Results There was a good linearity over the concentration ranges of 103000 ng?mL-1 (r=0.9986). The detection limit of this method was 10 ng?mL-1. The recovery and absolute recovery were 99.91%103.92% and 91.33%100.40%，respectively. The within?day and

5、between?day deviations were less than 15% and the chromatography peak tR was 1.67 min. Conclusion The method is sensitive，accurate，rapid and suitable for the determination of puerarin in human plasma.Key words:liquid chromatography-tandem mass spectrometry；puerarin；plasma concentration葛根素（puerarin）是

6、中藥葛根的主要成分之一，具有擴張冠脈血管、降低血壓和心肌耗氧量、抗心律失常等作用1。文獻報道的葛根素血藥濃度測定方法多數(shù)是高效液相色譜法2-4，但有時也難以滿足藥動學研究中微量血藥濃度的測定要求，且分析用時較長。本文建立測定葛根素血藥濃度的液相色譜?泊?聯(lián)質(zhì)譜（LC?MS?MS）法，具有簡便、靈敏度高、特異性強且檢測快速等優(yōu)點，適用于葛根素的藥動學研究。1 材料與方法1.1 儀器與試藥 美國AB公司API3000型液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)；Waters 20管型固相萃取儀；TECHNE樣品濃縮儀；Waters HLB固相萃取小柱(100 mg)。葛根素注射劑（浙江康恩貝制藥股份有限公司，0.25 g/5m

7、L）；葛根素、橙皮苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號分別為：0752?200108，0721?200104）；甲醇、乙腈為色譜純；醋酸胺為分析純；重蒸餾水。1.2 色譜及質(zhì)譜條件色譜柱：Aglient C18（150 mm2.1 mm，3.5 m），流動相：甲醇?10 mmol?L-1醋酸銨緩沖液?慘譯媯寤?比702010），流速為0.2 mL?min-1。輔助氣化電噴霧離子源（ESI），多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）模式正離子檢測，檢測離子對：m/z 417.2267.2（葛根素），m/z 611.2303.2（內(nèi)標橙皮苷），輔助氣化氣流量：7500 CC?min-1，霧化氣流量：8 L?mi

8、n-1，氣簾氣流量：8 L?min-1，碰撞氣流量：6 L?min-1，離子源噴霧電壓：5 500 V，離子源霧化溫度：350 。1.3 對照品及內(nèi)標溶液的配制 精密稱取適量的葛根素對照品，用甲醇溶解并定容得160 g?mL-1的對照品溶液；精密稱取適量的橙皮苷對照品，用甲醇溶解并定容得500 ng?mL-1的內(nèi)標溶液。1.4 血漿樣品處理 固相萃取小柱用1.0 mL甲醇活化和1.0 mL雙蒸水平衡，取血樣300 L加入10 mmol?L-1醋酸銨緩沖液300 L和內(nèi)標溶液20 L，混勻后上樣，雙蒸水1.0 mL洗滌，0.5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液于45 水浴下用N2吹干濃縮，加入150 L

9、流動相復溶，取5 L進樣。2 結(jié)果2.1 方法專屬性 根據(jù)葛根素和內(nèi)標物橙皮苷的子離子質(zhì)譜掃描結(jié)果（見圖1），分別選擇特異的m/z 417.2267.2和m/z 611.2303.2用于定量監(jiān)測。按照血漿樣品處理方法和檢測條件，空白血漿的色譜圖、空白血漿加葛根素和內(nèi)標對照品的色譜圖、用藥后血漿色譜圖，分別見圖2A、圖2B和圖2C。結(jié)果表明，葛根素和內(nèi)標物的保留時間分別為1.67 min和1.75 min，血漿中無內(nèi)源性物質(zhì)和基質(zhì)效應(yīng)干擾，方法特異性強。圖1 葛根素（1）和橙皮苷（2）的質(zhì)譜子離子掃描圖（略）Fig.1 Full scan MS-MS spectra of puerarin (1

10、) and hesperidin (2)A.空白血漿; B.空白血漿加入葛根素和橙皮苷對照品; C.兔給藥后血漿1.葛根素m/z 417.2267.2, tR=1.67 min; 2.橙皮苷 m/z 611.2303.2, tR=1.75 min圖2 血漿中葛根素和橙皮苷的色譜圖（略）Fig.2 Chromatograms of puerarin and hesperidin in plasma by LC?MS?MS2.2 標準曲線及線性范圍 取空白血漿加入葛根素對照品溶液，配制成濃度為10、30、100、300、1 000、3 000 ng?mL-1的血漿標準曲線樣品，按“1.4”項下方法

11、操作，計算葛根素與內(nèi)標峰面積比，得回歸方程為：Y=0.002 99C+0?002 34，r=0.998 6，權(quán)重1/X2。血漿中葛根素在103 000 ng?mL-1范圍內(nèi)與峰面積比線性關(guān)系良好，定量下限為10 ng?mL-1。2.3 精密度與相對回收率取空白血漿加入葛根素對照品溶液，制備濃度為10、1 500和2 500 ng?mL-1的血漿質(zhì)控樣品，按“1.4”項下方法操作測定，每個濃度的樣品在1d內(nèi)作5份樣品分析，連續(xù)測定3 d，計算方法的日內(nèi)和日間差，結(jié)果低、中、高3種濃度的日內(nèi)RSD分別為7.56%，4.43%，9.66% (n=5)；日間RSD分別為13.58%，7.20%，7.0

12、6%(n=15)；將實測值與真實值相比得相對回收率，結(jié)果低、中、高3種濃度的相對回收率分別為（103.9214.12）%，（99.917?19）%，（100.297.08）% (n=15)。2.4 提取回收率取空白血漿樣品按“1.4”項下提取、吹干，然后加入分別含10、1 500和2 500 ng?mL-1葛根素對照品的流動相150 L復溶(n=5)，使對照品溶液含空白血漿基質(zhì)，測定其峰面積并計算得均值A(chǔ)1，A2，A3；另取低、中、高濃度的質(zhì)控血漿各5份，按“1.4”項下方法操作、測定峰面積，分別與A1，A2，A3進行比較，計算本法的提取回收率(n=5)，分別為（91.3311.06）%，（1

13、00.407.97）%，（96.366.28）%。2.5 稀釋能力試驗取濃度為2 500 ng?mL-1的血漿質(zhì)控樣品5份，用空白血漿稀釋5倍后按“1.4”項下方法操作，將測定值乘稀釋因子后與標示值比較，準確度為（98.453.57）%。所以對高于定量上限的樣品可用空白血漿稀釋后測定。2.6 穩(wěn)定性試驗取低、中、高3種濃度的血漿質(zhì)控樣品各5份，分別在-75 保存5個月、室溫21 放置24 h及經(jīng)3個冷凍?踩誚庋?環(huán)處置，然后按“1.4”項下方法操作，測定值與真實值比較，相對偏差均15%，表明血漿樣品穩(wěn)定；血樣制備后的待測液在自動進樣器中放置6 h，其測定值與真實值比較，相對偏差均15%，表明待

14、測液在測定過程中也是穩(wěn)定的。2.7 兔體內(nèi)血藥濃度的測定取新西蘭兔6只（廣州中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供），雌雄兼有，體重2.02.5 kg，禁食12 h后于耳緣靜脈注射葛根素100 mg，于注射前、注射結(jié)束后0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12 h取耳緣靜脈血2 mL，置肝素抗凝管中，離心(3 500 r/min)15 min，吸取上層血漿進行分析，以標準曲線計算各時間點樣本中的葛根素濃度，同時測定質(zhì)控樣本以保證結(jié)果的可靠性。兔靜脈注射葛根素后的平均藥?彩鼻?線見圖3。3 討論葛根素選擇m/z 417.2267.2作為監(jiān)測離子對，特異性強且具有較高的儀器響應(yīng)值。以含醋酸銨緩沖液

15、的甲醇?慘譯孀魑?流動相，可使靈敏度進一步提高和有利于檢測體系穩(wěn)定。使用SPE法凈化血漿樣品，能有效消除LC?MS?MS法檢測生物樣品時常有的基質(zhì)效應(yīng)的影響，而且使用Waters HLB小柱，提取效率很高，本試驗曾對提取步驟中的洗滌液和二次甲醇洗脫液進行跟蹤檢測，均無葛根素的檢出。藥動學研究涉及一系列的血樣采集、保存、制備和測定等步驟，藥物在紛繁的操作過程中是否保持穩(wěn)定，需預先在方法學確證試驗中進行考察，穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，在上述條件下血樣中的葛根素是穩(wěn)定的。LC/MS/MS技術(shù)已開始在中藥藥動學研究得到應(yīng)用，其特異性強、靈敏度高等優(yōu)點可滿足在復雜的生物樣品中進行微量成分分析的要求。本試驗采用此技術(shù)測定中藥葛根素的血藥濃度，定量下限達到10 ng?mL-1，目標物和內(nèi)標物的保留時間均在2 min之內(nèi)，檢測快速。本方法的各項指標符合生物樣品定量分析方法學的要求，可用于藥動學研究的大量血樣的測定。圖3 兔靜脈注射葛根素100 mg后的平均血藥濃度?彩奔淝?線（n=6）（略）Fig.3 The concentration?time curve of puerarin in rabbit plasma after iv 100mg（n=6）【