高效液相色譜法測(cè)定瑞巴匹特的血藥濃度及其藥代動(dòng)力學(xué)研究

1、    高效液相色譜法測(cè)定瑞巴匹特的血藥濃度及其藥代動(dòng)力學(xué)研究        摘要目的：建立血漿中瑞巴匹特濃度的高效液相色譜分析方法，并用此方法研究瑞巴匹特在人體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)。方法：血樣經(jīng)酸化，用乙酸乙酯單步萃取后，以甲醇-pH3的磷酸鹽緩沖液(5248)為流動(dòng)相，在紫外230nm處檢測(cè)。所得數(shù)據(jù)用3p87藥代動(dòng)力學(xué)程序處理，求出相應(yīng)的參數(shù)。結(jié)果：瑞巴匹特血濃度在201200g.L-1范圍內(nèi)與色譜峰高呈良好線性關(guān)系，血漿中藥物最低檢測(cè)濃度為10g.L-1，日內(nèi)及日間RSD(

2、n=5)分別在1.11%3.72%和3.87%7.60%，方法回收率為99.84%100.20%。藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，口服國產(chǎn)和進(jìn)口瑞巴匹特片劑的血藥濃度-時(shí)間曲線均符合一級(jí)吸收一級(jí)消除的一房室模型，體內(nèi)藥物達(dá)峰時(shí)間分別為(1.95±0.73)h和(1.57±0.55)h；cmax分別為(510.8±152.0)g.L-1和(564.8±187.7)g.L-1；t1/2分別為(1.75±0.63)h和(1.66±0.3)h；國產(chǎn)瑞巴匹特片的相對(duì)生物利用度為(99.36±7.87)%。結(jié)論：此方法簡便、可靠，測(cè)定靈敏度高，能較

3、好地滿足瑞巴匹特臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)及人體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的研究。關(guān)鍵詞瑞巴匹特；高效液相色譜法；藥代動(dòng)力學(xué)HPLC assay for determination of rebamipide in plasma and its pharmacokinetic investigationZhao Rongsheng (Zhao RS),Duan Jingli (Duan JL),Yan Baoxia (Yan BX) (Department of Pharmacy,The Third Hospital of Beijing Medical University,Beijing100083)ABSTRA

4、CTOBJECTIVE:To establish a HPLC method for the determination of rebamipide in human plasma and investigate the pharmacokinetic characteristics of rebamipide in healthy volunteers after a singal oral dose.METHODS:The drug was extracted from plasma with ethyl acetate after acid purification，and then d

5、etected by UV detector at 230nm with a mobile phase consisting of methanol：phosphate buffer (5248).The data obtained were fitted with 3P87 program on computer.RESULT:A linear relationship was obtained between the peak height and the concentration of rebamipide from 20g.L-1 to 1200g.L-1 and the limit

6、 of detection was 10g.L-1.The average relative deviations (RSD) of within day and between day variation were 1.113.72% and 3.877.60% (n=5) respectively.The recoveries of rebamipide were 99.48100.20%.The results showed that the plasma concentration-time curve of the two preparations were all fitted t

7、o a one-compartment model with first order absorption and elimination.Tpeak of domestic and imported tablets were 1.95±0.73 and 1.57±0.55h;cmax were 510.8±152.0 and 564.8±187.7g.L-1;t1/2 were 1.75±0.63 and 1.66±0.31h;respectively.CONCLUSION:This experiment established a

8、 simple,highly sensitive and selective method for the determination of plasma rebamipide levels in humans.It provides a suitable analysis method for its pharmacokinetic studies.KEYWORDSrebamipide,HPLC,pharmacokinetics瑞巴匹特(rebamipide)是日本大?公司90年代初開發(fā)的一種新型胃炎、胃潰瘍防治藥。它能促進(jìn)胃粘膜中前列腺素的合成，通過加強(qiáng)胃粘膜的防御功能來防治胃潰瘍12。目

9、前，國內(nèi)外對(duì)該藥的研究都不多，關(guān)于瑞巴匹特血藥濃度檢測(cè)的方法國內(nèi)尚未見報(bào)道，國外僅有兩篇文獻(xiàn)23報(bào)道，均為高效液相色譜熒光檢測(cè)法，但該法樣品制備處理復(fù)雜。本實(shí)驗(yàn)建立了瑞巴匹特反相高效液相色譜紫外檢測(cè)方法，并用該法對(duì)10名健康志愿者口服國產(chǎn)和進(jìn)口瑞巴匹特后的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，取得了滿意的結(jié)果。1材料和方法1.1藥品和試劑國產(chǎn)瑞巴匹特片(浙江海寧強(qiáng)力寧制藥有限公司，100mg/片，批號(hào)：960814)；進(jìn)口瑞巴匹特片(商品名：Mucosta,日本大?藥廠，100mg/片，批號(hào)：6 J84 MT5)；瑞巴匹特標(biāo)準(zhǔn)品(浙江海寧強(qiáng)力寧制藥有限公司提供，上海醫(yī)工院研制合成)；甲醇、磷酸(分析純，北京化

10、工廠)；磷酸二氫鉀(分析純，北京紅星化工廠)，乙酸乙酯(分析純，北京化工三廠)，乙酸乙酯臨用前重蒸；水為重蒸餾去離子水。1.2儀器及色譜條件SP8810高效液相色譜泵，Spectra UV2000紫外檢測(cè)器，SP4290積分儀(美國TSP)；YKH-型液體快速混合器(江西醫(yī)療器械廠)；TGL-16C型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。色譜柱：Spheri-5 RP-18，220mm×4.6mm(美國TSP公司)；流動(dòng)相：甲醇-0.05mol.L-1 pH3的磷酸鹽緩沖液(5248)，過濾并脫氣；流速：1.0ml.min-1；紫外檢測(cè)波長：230nm；積分儀衰減為16；紙速0.25mm.m

11、in-1。1.3血樣的采集健康男性志愿者10人，經(jīng)檢查心、肝、腎功能均為正常，試驗(yàn)前兩周未服用過任何藥物。受試者交叉po單劑量600mg國產(chǎn)和進(jìn)口瑞巴匹特片，分別于服藥前及服藥后0.25，0.5,1,1.5,2,3,4,6,8,12及24h各采取靜脈血4ml，置肝素抗凝管中，分離血漿后置于-20冰箱保存待測(cè)。間隔一周后交叉給藥，重復(fù)試驗(yàn)。1.4樣品處理方法精密吸取人血漿樣品1.0ml置于10ml刻度離心管中，加入1mol.L-1磷酸溶液0.5ml，乙酸乙酯2.0ml，渦旋振蕩2min，3000r.min-1離心5min，精密吸取上層有機(jī)相1.0ml，置1.5ml離心管中，60水浴下氮?dú)獯蹈?，?/p>

12、100l甲醇溶解后渦旋振蕩1min，12 000r.min-1離心5min，取20l進(jìn)樣，進(jìn)行液相色譜分析。1.5血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線制作于健康人空白血漿中加入不同量的瑞巴匹特標(biāo)準(zhǔn)液，使其濃度分別為20，50，100，200，400，800，1200g.L-1，樣品處理方法同上，經(jīng)HPLC測(cè)定，以峰高H為縱坐標(biāo)，藥物濃度c(g.L-1)為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.6方法精密度和回收率方法精密度：在空白血漿中精密加入不同量的瑞巴匹特標(biāo)準(zhǔn)品，使血漿濃度分別為50，200，600g.L-1，按前法分別于日內(nèi)和日間提取，測(cè)定日內(nèi)變異和日間變異。方法回收率：在空白血漿中精密加入不同量的瑞巴匹特標(biāo)準(zhǔn)品，

13、使血漿濃度分別為50，200，600g.L-1，按前法處理，測(cè)定血漿中瑞巴匹特的相對(duì)回收率。絕對(duì)回收率：在空白血漿中精密加入一定量的瑞巴匹特標(biāo)準(zhǔn)品，配制成濃度分別為50，200，600g.L-1的血漿樣品，再以流動(dòng)相代替血漿配制成同樣濃度的樣品作為對(duì)照組樣品，按前法進(jìn)行處理，測(cè)定色譜峰高，將血樣與對(duì)照組相應(yīng)峰高比較得絕對(duì)回收率。1.7藥代動(dòng)力學(xué)研究血藥濃度測(cè)定結(jié)果用3P87程序處理，并計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)及國產(chǎn)制劑的相對(duì)生物利用度。2結(jié)果2.1色譜行為空白血樣及服用瑞巴匹特后血樣的色譜，見1。由譜可見，在本試驗(yàn)所選分析條件下，瑞巴匹特與血漿中內(nèi)源性組分得到良好分離，瑞巴匹特的保留時(shí)間為8.15m

14、in。1空白血漿及含藥血漿色譜A-空白血漿；B-含藥血漿2.2線性關(guān)系與檢測(cè)限本法血漿中瑞巴匹特濃度在201200g.L-1范圍內(nèi)，峰高H與濃度c呈線性相關(guān)，回歸后得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：H=284.0+22.7c,(r=0.9999)。該方法的最低檢測(cè)濃度為10g.L-1。2.3精密度在本試驗(yàn)條件下，將高、中、低不同濃度的瑞巴匹特血漿樣品分別于日間和日內(nèi)提取進(jìn)樣，測(cè)定日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差、日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差，其RSD分別在1.11%3.72%，3.87%7.60%范圍內(nèi)，結(jié)果見表1。表1HPLC測(cè)定血漿中瑞巴匹特的精密度.n=5濃度/g.L-1日內(nèi)日間實(shí)測(cè)值RSD/%實(shí)測(cè)值RSD/%5045.02±

15、;1.683.7250.19±3.817.60200197.06±5.112.59195.32±7.563.87600623.28±6.911.11592.30±25.674.332.4方法回收率在本實(shí)驗(yàn)條件下，人血漿中不同濃度藥物的平均回收率在98.31%100.20%范圍內(nèi)，結(jié)果見表2。 表2回收率試驗(yàn)結(jié)果.n=5濃度/g.L-1實(shí)測(cè)值/g.L-1回收率/%RSD/%5049.74±2.6399.48±5.265.29200196.62±5.5698.31±2.782.83600601.20±

16、;6.40100.20±3.203.192.5絕對(duì)回收率在本實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)得的人血漿中不同濃度藥物的絕對(duì)回收率結(jié)果見表3。 表3瑞巴匹特在血漿中的絕對(duì)回收率.n=5濃度/g.L-1絕對(duì)回收率/%平均回收率/%RSD/%92.905089.1292.183.094.5196.0720097.2095.212.792.3596.0960095.2994.622.092.472.6藥代動(dòng)力學(xué)研究10名健康志愿者交叉po兩種制劑后的藥時(shí)曲線經(jīng)計(jì)算機(jī)擬合一室模型與二室模型間無顯著差異(P0.05)，以一級(jí)吸收一級(jí)消除的一房室模型為優(yōu)，見2。po兩種制劑后的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表4，國產(chǎn)瑞巴匹特

17、片的相對(duì)生物利用度為(99.36±7.87)%，其RSD為7.92%。210名健康志愿者po單劑量600mg瑞巴匹特后平均血藥濃度-時(shí)間曲線-國產(chǎn)；-進(jìn)口表4健康志愿者po單劑量瑞巴匹特片600mg后的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)參數(shù)國產(chǎn)片進(jìn)口片t1/2Ke/h1.75±0.631.66±0.31t1/2Ka/h0.83±0.360.68±0.38Lag time/h0.23±0.230.17±0.13V/F/L×1030.69±0.340.62±0.11Cl/F(s)/L.h×10-30.27&#

18、177;0.050.27±0.07tmax/h1.95±0.731.57±0.55cmax/g.L-1510.8±152.0564.8±187.7AUC/g.h.L-12506.9±413.92549.7±513.13討論3.1瑞巴匹特的理化性質(zhì)比較特別，它難溶于甲醇和乙醇，幾乎不溶于水和乙醚，po瑞巴匹特后，體內(nèi)血藥濃度很低，cmax僅為數(shù)百ng，這都使得血漿中藥物的萃取濃集非常不易。國外文獻(xiàn)報(bào)道的血漿樣品制備方法步驟繁瑣，而且測(cè)定時(shí)有較多雜質(zhì)干擾；本實(shí)驗(yàn)試用了多種萃取方法及各種不同的提取取有機(jī)溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在弱酸性條件

19、下用乙酸乙酯提取，可達(dá)較高提取效率，且測(cè)定時(shí)血漿雜質(zhì)干擾少。精密度及回收率試驗(yàn)表明，本法準(zhǔn)確、可靠，且重現(xiàn)性好；國外文獻(xiàn)采用熒光檢測(cè)器測(cè)定血藥濃度，最低檢測(cè)限為10ng.ml-1，本試驗(yàn)用紫外檢測(cè)器測(cè)定，最低檢測(cè)限亦可達(dá)10ng.ml-1，可見本法的靈敏度較高。3.2由于瑞巴匹特與血漿中某些內(nèi)源性成分的性質(zhì)相似，影響了測(cè)定時(shí)的分離效果。本試驗(yàn)通過改變流動(dòng)相的配比和pH來選擇最佳分離條件，結(jié)果表明，最佳分離的流動(dòng)相組成為甲醇-緩沖液(5248)，最佳分離pH為3，在選定的試驗(yàn)條件下，瑞巴匹特與血漿中組分能達(dá)到基線分離。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，用甲醇溶解樣品后，在進(jìn)樣前再以12000r.min-1離心，可使測(cè)定時(shí)血漿雜質(zhì)峰減少。3.3將每位志愿者的藥時(shí)數(shù)據(jù)用3P87藥代動(dòng)力學(xué)程序處理后，擬合出藥代動(dòng)力學(xué)模型，并求得相應(yīng)的體內(nèi)參數(shù)，結(jié)果表明，國產(chǎn)瑞巴匹特與進(jìn)口瑞巴匹特生物等效，二者在健康人體內(nèi)吸收分布等性質(zhì)相似。試驗(yàn)結(jié)果表明，本法能較好地滿足瑞巴匹特臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)及體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究。 作者單位：