細胞凋亡與角膜移植免疫反應關系的初步研究

1、細胞凋亡與角膜移植免疫反應關系的初步研究 06-07-04 15:05:00 編輯：studa20 作者：楊朝忠，張 軍，華 山，吳艷蕊，祝東升，馬路生【摘要】 目的 研究細胞凋亡信號分子Fas和細胞凋亡因子FasL在新鮮及深低溫保存后角膜的表達情況、角膜細胞凋亡情況及其與角膜移植免疫排斥反應的關系。方法 （1）對35例角膜移植手術（25例新鮮角膜、10例冷凍保存）剩余組織應用免疫組織化學SABC法分別進行Fas和FasL蛋白染色。（2）應用Tunel法對上述標本進行細胞凋亡的研究。（3）觀察35例部分穿透性角膜移植免疫排斥反應發(fā)生發(fā)展情況。結果 （1）角膜細胞Fas蛋白及FasL蛋白均為細胞

2、質和（或）細胞膜著色。角膜上皮細胞、基質細胞及內皮細胞Fas蛋白均呈陽性表達。角膜上皮細胞及內皮細胞FasL蛋白均呈陽性表達，而角膜基質細胞則無FasL蛋白表達。新鮮角膜和冷凍保存后角膜的Fas、FasL蛋白陽性表達量經(jīng)統(tǒng)計學分析差異無顯著性。（2）凋亡的角膜細胞均為細胞核著色。25例新鮮角膜平均每高倍視野可見凋亡細胞（1.7880.621）個，經(jīng)冷凍保存后的角膜（10例）每高倍視野可見凋亡細胞平均為（8.1642.126）個，經(jīng)統(tǒng)計學處理P0.05，差異有顯著性。（3）角膜移植免疫排斥反應發(fā)生與角膜的新鮮程度有關，新鮮角膜部分穿透性角膜移植術后612個月的免疫排斥反應發(fā)生率為12%（3/25

3、），深低溫保存角膜移植后612個月的免疫排斥反應發(fā)生率為10%（1/10），二者差異無顯著性（P0.05）。結論 （1）新鮮和深低溫保存后的角膜均可見Fas、FasL蛋白的表達。其中Fas在角膜上皮、基質和內皮細胞均表達，F(xiàn)asL在角膜上皮、內皮細胞表達，而基質細胞不表達。（2）新鮮角膜可見極少量凋亡細胞，角膜經(jīng)深低溫冷凍保存后，凋亡細胞數(shù)量顯著增加。降溫-復溫損傷可能與細胞凋亡有關。（3）角膜移植免疫排斥反應發(fā)生與角膜的新鮮程度有一定關系，深低溫保存后角膜的抗原性可能降低，不易引起免疫排斥反應的發(fā)生。 【關鍵詞】 Fas蛋白；FasL蛋白；凋亡；角膜移植免疫排斥 【Abstract】 Obj

4、ective To investigate the relationship between expression of Fas/FasL and apoptotic cells in normal cornea and deep cryopreservative with cornea graft rejection in human.Methods SABC immunohistochemistry method was applied to study the expression of Fas/FasL in paraffin-embeded sections of 35 cornea

5、.The tunel(TdT mediated biotin dUTP nick-end labeling，TUNEL) technique was used to study whether apoptosis would happy in both normal cornea and deep cryopreservative in human.Results In all positive cells，F(xiàn)as/FasL were kytoplasm and cell membrane was stained.The positive expression of Fas protein w

6、as detected in 35/55 cornea，so was Fasl protein.Fas protein is expressed in corneal epithelial，keratocyte and endothelial cells.FasL ligand protein was detected in corneal epithelial and endothelial，neither was keratocyte cells.The number of apoptotic cells was significantly higher after cryopreserv

7、ation(8.1642.126) than noncryopreservation (1.7880.621) (P0.05).The rate of cornea graft rejection was 12%(nomal cornea) and 10%(cryopreservative cornea).Conclusion Fas protein and FasL ligand protein expressed in all cornea were not related to cryopreservation.The freeze-thaw trauma was maybe relat

8、ed to cryopreservation-induced cell apoptosis.It may reduce the rate of cornea graft rejection. 【Key words】 Fas protein；FasL protein；apoptosis；cornea graft rejection 角膜病是常見的致盲眼病，居致盲眼病的第二位。角膜移植手術是治療角膜盲的重要手段。角膜材料的質量是影響角膜移植手術成功與否的主要因素。在保存過程中角膜細胞特別是角膜內皮細胞常受損，其可能的機制為死亡和細胞凋亡。Fas/FasL是與細胞凋亡密切相關的一對基因。FasL在角

9、膜的廣泛分布對維持角膜的免疫赦免地位和角膜移植的高成功率有重大意義。目前，角膜Fas/FasL及細胞凋亡與角膜移植免疫排斥反應關系的研究尚少。本文就細胞凋亡與角膜移植免疫排斥反應關系的初步研究結果報告如下。 1 對象與方法 1.1 研究對象 35例(35眼)角膜移植患者系20002002年隨即就診，為單純性角膜白斑，植片為77.75mm部分穿透性角膜移植，男23例(23眼)，女12例(12眼)；角膜為本院眼庫提供，25例新鮮角膜，10例為深低溫冷凍保存角膜。手術時將剩余角膜用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，5m切片。冷凍保存法采用簡易二步法深低溫保存1，冷凍時間1周10個月，平均冷凍時間為（5

10、.123.47）個月。 1.2 試劑及主要器械 Fas、FasL蛋白染色及Tunel法細胞凋亡試劑（武漢博士德公司分裝的即用型試劑盒）；深低溫保存角膜試劑有二甲基亞楓（DMSO），20%人血白蛋白，液氮，QL-型生物降溫儀。 1.3 實驗方法 1.3.1 Fas、FasL蛋白免疫組織化學檢測方法 采用即用型SABC法。陽性對照組：Fas、FasL試劑盒中自帶陽性對照片作為陽性對照組；陰性對照組：用PBS代替一抗作為陰性對照組。 1.3.2 細胞凋亡檢測 采用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的DNA缺口生物素-dUTP標記法2（TdT mediated biotin dUTP nick-end labe

11、ling，TUNEL）原位標記。 1.4 實驗結果判斷 1.4.1 Fas、FasL判斷 以細胞膜和（或）細胞質有清晰棕黃色顆粒著色為陽性染色細胞，細胞膜或細胞質無清晰棕黃色顆?；驘o著色為陰性。 1.4.2 凋亡細胞判斷 以細胞核呈棕黃色著色為陽性染色細胞，胞核無棕黃色著色為陰性細胞。每張切片隨機取6個視野（高倍鏡下）記數(shù)，取平均值為該片凋亡細胞數(shù)。 1.5 統(tǒng)計學方法 根據(jù)資料性質，分別采用完全隨機設計資料的方差分析和t檢驗。P0.05為差異有顯著性。本實驗所有統(tǒng)計均用SPSS統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。 2 結果 2.1 角膜細胞Fas蛋白及FasL蛋白全為細胞質和（或）細胞膜著色 35例角膜

12、上皮細胞、基質細胞及內皮細胞Fas蛋白均呈陽性表達。角膜上皮細胞及內皮細胞FasL蛋白均呈陽性表達，而角膜基質細胞則無FasL蛋白表達。新鮮角膜和冷凍保存后角膜的Fas、FasL蛋白陽性表達量經(jīng)統(tǒng)計學分析差異無顯著性。 2.2 細胞凋亡檢測結果 2.2.1 凋亡細胞特征 發(fā)生凋亡的細胞皺縮，核的改變最明顯，典型的染色質斷裂、分離、濃縮形成密集顆粒，聚集于核被膜下呈新月形或帽狀。繼續(xù)發(fā)展可出現(xiàn)凋亡小體，其特點是具備完整的膜狀結構，胞膜表面微絨毛消失，內容物除了胞質以外，主要含有降解的染色質片段。本實驗采用Tunel方法檢測，DAB作為顯色底物，顯微鏡下觀察，細胞核含有棕黃色顆粒的細胞即為陽性細胞

13、。 2.2.2 深低溫保存與角膜細胞凋亡的關系 本實驗結果發(fā)現(xiàn)，所有陰性對照組均未見Tunel陽性細胞；陽性對照組可見大量Tunel陽性細胞。新鮮角膜僅在上皮層偶發(fā)現(xiàn)少許凋亡細胞，經(jīng)冷凍保存后，凋亡細胞顯著增加，上皮、基質和內皮細胞層均可見到凋亡細胞。見表1。表1 新鮮角膜及冷凍保存后凋亡細胞情況 (xs) 由表1可見，深低溫冷凍保存后角膜的凋亡細胞數(shù)量明顯較新鮮角膜增加，二者差異有顯著性（P0.05），冷凍-復溫損傷與細胞凋亡可能有關。 2.3 角膜移植免疫排斥反應發(fā)生與角膜的新鮮程度有關 新鮮角膜部分穿透性角膜移植術后612個月的免疫排斥反應發(fā)生率為12%（3/25），深低溫保存角膜移植后

14、612個月的免疫排斥反應發(fā)生率為10%（1/10），二者差異無顯著性（P0.05）。 3 討論 角膜的高度透明性是實現(xiàn)視覺器官正常生理功能的重要條件之一，而解剖形態(tài)完整和生理功能正常的角膜內皮層對于保持角膜的半脫水狀態(tài)、正常厚度及透明性起著關鍵性作用。當各種原因致角膜內皮細胞降至其生理界限值以下時，就會產(chǎn)生功能失代償，導致角膜水腫進而混濁。據(jù)報道角膜盲占全球盲目的1/33，穿透性角膜移植手術是其復明的主要治療方法。眼庫的設立使這些患者行角膜移植手術的可能性大大增加，但是供體角膜來源的短缺及術后免疫排斥反應的發(fā)生直接影響著角膜移植手術的開展和成敗4。故提高眼庫保存技術和保存質量尤為重要。目前，眼

15、庫常用的角膜保存方法有短期（濕房）、中期及長期（深低溫）保存法5。其中深低溫保存法保存角膜時間最長，可為無眼庫地區(qū)提供角膜。但一些因素，如供體角膜離體時間、降溫和復溫的速率、保存液的組分等均可影響角膜保存質量、導致角膜細胞尤其角膜內皮細胞損失，其可能的機制一為死亡，二為細胞凋亡。 凋亡是一種基因介導的生理過程6，在多細胞生物體的胚胎發(fā)育分化、組織塑型、組織自穩(wěn)的維持和調節(jié)、組織受損后細胞再生及腫瘤回退過程中都起著重要的作用7，8。分子生物學研究發(fā)現(xiàn)有大量的基因與細胞死亡和抗細胞死亡有關。在這些基因中有Ced-3(IL-1轉換酶樣半胱氨酸蛋白酶）、p53（一種腫瘤抑制因子)、bc1-2（一種細胞凋亡抑制基因）、bax(bc1-2家庭成員之一)。Fas和FasL也在其中，二者構成了一條獨特的細胞凋亡通路，參與了多種疾病的病理生理過程，具有潛在的臨床應用價值，已成為凋亡研究領域的新熱點。 Fas是新近發(fā)現(xiàn)的細胞凋亡的信號分子9，1