蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定(四)──考馬斯亮藍(lán)染色法

1、實(shí)驗(yàn)九 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定(四考馬斯亮藍(lán)染色法 目的要求 學(xué)習(xí)考馬斯亮藍(lán)（Coomassie Brilliant Blue）法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理和方法。 實(shí)驗(yàn)原理 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)染料結(jié)合的原理，定量的測(cè)定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法?？捡R斯亮藍(lán)G250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍(lán)色。它和蛋白質(zhì)通過(guò)范德華力結(jié)合，在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律（Beers law）。此染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色有紅色形式和藍(lán)色形式，最大光吸收由465nm變成595nm，通過(guò)測(cè)定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的

2、量。蛋白質(zhì)和染料結(jié)合是一個(gè)很快的過(guò)程，約2min即可反應(yīng)完全，呈現(xiàn)最大光吸收，并可穩(wěn)定1h，之后，蛋白質(zhì)染料復(fù)合物發(fā)生聚合并沉淀出來(lái)。蛋白質(zhì)染料復(fù)合物具有很高的消光系數(shù)，使得在測(cè)定蛋白質(zhì)濃度時(shí)靈敏度很高，在測(cè)定溶液中含蛋白質(zhì)5µL/ml時(shí)就有0.275光吸收值的變化，比Lowry法靈敏4倍，測(cè)定范圍為10100µg蛋白質(zhì)，微量測(cè)定法測(cè)定范圍是110µg蛋白質(zhì)。此反應(yīng)重復(fù)性好，精確度高，線性關(guān)系好。標(biāo)準(zhǔn)曲線在蛋白質(zhì)濃度較大時(shí)稍有彎曲，這是由于染料本身的兩種顏色形式光譜有重疊，試劑背景值隨更多染料與蛋白質(zhì)結(jié)合而不斷降低，但直線彎曲程度很輕，不影響測(cè)定。此方法干擾物少，

3、研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4無(wú)干擾。強(qiáng)堿緩沖液在測(cè)定中有一些顏色干擾，這可以用適當(dāng)?shù)木彌_液對(duì)照扣除其影響。Tris，乙酸，2巰基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污劑如Triton X100，SDS，玻璃去污劑有少量顏色干擾，用適當(dāng)?shù)木彌_液對(duì)照很容易除掉。但是，大量去污劑的存在對(duì)顏色影響太大而不易消除。  試劑與器材 一、試劑考馬斯亮藍(lán)試劑：考馬斯亮藍(lán)G250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1000ml，濾紙過(guò)濾。最終試劑中含0.01%(W/V考馬斯亮藍(lán)G250，4.7%(W/V乙

4、醇。 二、標(biāo)準(zhǔn)和待測(cè)蛋白質(zhì)溶液1標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液結(jié)晶牛血清蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量，根據(jù)其純度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml，0.1mg/ml蛋白溶液。2未知蛋白質(zhì)溶液。 三、器材試管及試管架， 移液管（0.1ml及5ml），UV2000型分光光度計(jì)。  操作方法 一、標(biāo)準(zhǔn)法制定標(biāo)準(zhǔn)曲線取14支試管，分兩組按下表a平行操作。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以A595nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。表a試管編號(hào)01234561mg/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液/ml00.010.020.030.040.050.060.

5、15mol/L NaCl/ml0.10.090.080.070.060.050.04考馬斯亮藍(lán)試劑/ml5ml搖勻，1h內(nèi)以0號(hào)管為空白對(duì)照，在595nm處比色A595nm  二、微量法制定標(biāo)準(zhǔn)曲線取12支試管，分兩組按下表b平行操作。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以A595nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。表b試管編號(hào)0123451mg/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液/ml00.010.020.030.040.050.15mol/L NaCl/ml0.10.090.080.070.060.05考馬斯亮藍(lán)試劑/ml5ml搖勻，1h內(nèi)以0號(hào)管為空白對(duì)照，在595nm處比色A595

6、nm 三、未知樣品蛋白質(zhì)濃度測(cè)定測(cè)定方法同上，取合適的未知樣品體積，使其測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍內(nèi)。根據(jù)所測(cè)定的A595nm值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量，從而計(jì)算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）。  注意事項(xiàng) （1） （1） 如果測(cè)定要求很?chē)?yán)格，可以在試劑加入后的520min內(nèi)測(cè)定光吸收，因?yàn)樵谶@段時(shí)間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的。（2） （2） 測(cè)定中，蛋白染料復(fù)合物會(huì)有少部分吸附于比色杯壁上，實(shí)驗(yàn)證明此復(fù)合物的吸附量是可以忽略的。測(cè)定完后可用乙醇將藍(lán)色的比色杯洗干凈。  思考題：根據(jù)下列所給的條件和要求，選擇一種或幾種常用蛋白質(zhì)定量方法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度：（1） （