克隆形成實驗

1、克隆形成實驗細(xì)胞生長狀況有關(guān)指標(biāo)的檢測方法一、細(xì)胞計數(shù) 這是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的基本技術(shù)之一。所用材料為血球計數(shù)板，巴氏吸管和顯微鏡。細(xì)胞計數(shù)的基本步驟：(1) 取清潔計數(shù)板和專用蓋玻片，用絲綢布輕輕拭干 . 取細(xì)胞懸液0.3mL,加入0.9mL結(jié)晶紫(或臺盼至)染液，混勻后滴半滴于血球計數(shù)板內(nèi)，以充滿不外溢 為宜。也可直接將細(xì)胞懸液在一側(cè)滴加到蓋玻片中，不要溢出，也不要過少或出現(xiàn)氣泡.(3)在顯微鏡下用10X物鏡觀察計數(shù)四角大分格中的細(xì)胞數(shù)。代入下式得出細(xì)胞密度。細(xì)胞數(shù)/ml=(4大格細(xì)胞數(shù)之和/4) X104端釋倍數(shù)臺盼藍(lán)染色法可計算出活細(xì)胞數(shù)和死細(xì)胞數(shù)以測定細(xì)胞存活百分率。一般0.5%1%勺

2、臺盼藍(lán)染液可使死細(xì)胞染成藍(lán)色，活細(xì)胞不著色。此外還可用0.02%的藻紅 B 染液將死細(xì)胞或受損細(xì)胞染成紅色，或用 0.05%的苯胺黑染液將死細(xì)胞染成黑色。細(xì)胞存活百分率=(4大格活細(xì)胞數(shù)/4大格活細(xì)胞+死細(xì)胞數(shù))X100% 細(xì)胞計數(shù)除用上述方法外，目前還有新型的自動計數(shù)儀，可供大規(guī)模細(xì)胞計數(shù)工作使用。各種型號的計數(shù) 操作不盡相同，可根據(jù)使用說明進(jìn)行操作。在進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)操作時，必須把細(xì)胞懸液準(zhǔn)備好，細(xì)胞應(yīng)分散良好，并充分混勻，若出現(xiàn)較多細(xì)胞團(tuán)或細(xì)胞數(shù)少于200個/10mm2或多于500個/10mm2時，需重制細(xì)胞懸液，重新計數(shù)。二、細(xì)胞生長曲線和生長倍數(shù)細(xì)胞生長曲線是細(xì)胞培養(yǎng)實驗中最基本的指標(biāo)，

3、是測定細(xì)胞絕對增長數(shù)值和生長繁殖基本規(guī)律常用的簡便 方法。常用的方法為：在同一規(guī)格的培養(yǎng)瓶中，接種同等量的同一代細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后每隔24小時取出幾瓶細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，以培養(yǎng)時間為橫座標(biāo)，不同時刻的細(xì)胞數(shù)的對數(shù)為底座標(biāo)，標(biāo)出各點并連成線，即為該細(xì) 胞的生長曲線，可反應(yīng)出細(xì)胞生長的動態(tài)。測定生長曲線的另一種方法是用96 孔/24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分 7 組，每組 3 孔，培養(yǎng)一周 (7 天) ，期間逐日檢測一組，計數(shù)，最后把 7 天中的細(xì)胞數(shù)值繪成圖，即為細(xì)胞生長曲線。也可采用MTT法來進(jìn)行生長曲線測定，較上述方法簡便。標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞生長曲線近似 S形，一般在傳代后第一天細(xì)胞數(shù)有所減少，經(jīng)過一段時間的潛伏期，

4、再進(jìn)入對 數(shù)生長期，達(dá)到平臺期和生長穩(wěn)定，最后衰老。細(xì)胞生長倍數(shù)是指測定接種時活細(xì)胞的濃度，經(jīng)一個生長周期達(dá)到最大活細(xì)胞濃度的比率。生長倍數(shù) =培養(yǎng)后最大活細(xì)胞濃度 /接種時的活細(xì)胞濃度三、細(xì)胞分裂指數(shù)細(xì)胞分裂指數(shù)是表示細(xì)胞增殖旺盛程度的指標(biāo)。它以被測 1000個細(xì)胞中的分裂細(xì)胞數(shù)來計算。其方法為： 用秋水仙素將細(xì)胞處理 1 2小時后，按染色體制片法制片并染色，計算 1000個細(xì)胞中分裂相的數(shù)目，重 復(fù)4 次取平均值，用百分比表示。基本步驟：(1) 細(xì)胞準(zhǔn)備 用蓋片 (支持物 ) 培養(yǎng)法。(2) 每24小時取出一個小玻片，按常規(guī)方法進(jìn)行固定，吉姆薩或HE染色，封片，制成永久標(biāo)本。(3) 顯微鏡

5、下選擇細(xì)胞密度適中的區(qū)域觀察分裂細(xì)胞并計數(shù)。 逐個視野進(jìn)行， 對每一時間組的玻片各取細(xì)胞 多、中、少 3 個區(qū)域各一區(qū)，共數(shù) 1000個細(xì)胞，計算出平均分裂相值所占百分比。觀察時要掌握好分裂相 標(biāo)準(zhǔn)，主要是確定好劃分間期和前期，末期和間期等的界限，以減少誤差。細(xì)胞分裂指數(shù)=細(xì)胞分裂相數(shù)/細(xì)胞總數(shù)(1000) X1000四、細(xì)胞接種存活率細(xì)胞接種存活率又稱細(xì)胞貼壁率。它是細(xì)胞被制成分散的懸液后，以低密度（25個細(xì)胞/cm2）被接種到底物上，貼壁并能存活生長形成細(xì)胞小群（克隆）的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)值，用以表示細(xì)胞的生存能力和細(xì)胞群的活力。 基本步驟：（1 ）取對生長期細(xì)胞，用消化法制成細(xì)胞懸液，計數(shù)后按檢

6、測細(xì)胞生長曲線的接種細(xì)胞的原則，將細(xì)胞接 種于培養(yǎng)瓶（濃度相對高些）。接種1215瓶。（2 ）每2小時取出一瓶細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)液，然后加入胰酶消化已貼壁細(xì)胞，計數(shù)已貼壁細(xì)胞，用下面公式 逐個計算每個時間上的貼壁率。每2小時一次，共觀察 24小時即12。接種存活率（貼壁率）=（貼壁存活細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）X100%五、克隆形成率細(xì)胞接種存活率只表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞數(shù)，但貼壁后的細(xì)胞不一定每個都能增殖和形成克隆。而形 成克隆的細(xì)胞必為貼壁和有增殖活力的細(xì)胞。克隆形成率反映細(xì)胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀。由于細(xì)胞生物學(xué)性狀不同，細(xì)胞克隆形成率差別也很大，一般初代培養(yǎng)細(xì)胞克隆形成率弱，傳代細(xì)胞

7、系強(qiáng)；二倍體細(xì)胞克隆形成率弱，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系強(qiáng)；正常細(xì)胞克隆形成率弱，腫瘤細(xì)胞強(qiáng)。并且克隆形成率與接種 密度有一定關(guān)系，做克隆形成率測定時，接種細(xì)胞一定要分散成單細(xì)胞懸液，直接接種在碟皿中，持續(xù)一 周，隨時檢查，到細(xì)胞形成克隆時終止培養(yǎng)。1、平板克隆形成試驗基本步驟：（1）取對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細(xì)胞，把細(xì)胞懸浮在10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中備用。（2）將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋， 以適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度（根據(jù)增殖能力）接種于培養(yǎng)皿中。一般分每皿50、100、 200個細(xì)胞的梯度密度分別接種含 10mL37C預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動，使細(xì)胞分散均勻。

8、置37C 5% CO2及飽和濕度的環(huán)境下，靜置培養(yǎng) 23周。經(jīng)常觀察，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加純甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL，固定15分鐘。然后去固定液，加適量 Giemsa應(yīng)用染色液染1030分鐘，然后 用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。（4）將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計數(shù)克隆，或在顯微鏡（低倍鏡）計數(shù)大于10個細(xì)胞的克隆數(shù)。最后計算克隆形成率?？寺?shù)克隆形成率=X100%接種細(xì)胞數(shù)平板克隆形成試驗方法簡單，適用于貼壁生長的細(xì)胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗成功的關(guān)鍵是 細(xì)胞懸液的制備和接種密度。細(xì)胞一定要分散得好

9、，不能有細(xì)胞團(tuán)，接種密度不能過大。2、軟瓊脂培養(yǎng)克隆形成試驗基本步驟：（1）取對數(shù)生長期細(xì)胞，用 0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細(xì)胞，作活細(xì)胞計數(shù)，用含20%|臺牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至 1 X106細(xì)胞/L。然后根據(jù)實驗要求作梯度倍數(shù)稀釋。（2）用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個濃度的低溶點瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40C中不會凝固。（3）按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2 XDMEM培養(yǎng)基（含有2X抗生素和20%的小牛血清）混合后，取3mL混合液注入直徑6cm平皿中（10cm平皿加710mL），冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用。按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2XDME培養(yǎng)基在無菌試管中相混以后，再向管中加入0.2mL的細(xì)胞懸液， 充分混勻，注入鋪有 1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37C 5%CO2溫箱中培養(yǎng)1014天。(5) 把平皿放置在倒置顯微鏡下，