qPCR試驗操作流程

1、Q-PCR實驗流程一、實驗前準備，每天早上到實驗室后，先把超凈工作臺的紫外燈打開15-20分鐘。超凈臺前做實驗，需佩戴干凈的橡膠手套/一次性薄 膜手套，RNA抽提需帶口罩。取EP管/槍頭時需用鑷子，不可以 用使用過的手套直接取用。取完 EP管/槍頭后，袋子及時封好。橡 膠手套須放入超凈臺照射紫外，實驗操作過程中不得帶出超凈臺，移 液器在一天工作結(jié)束后調(diào)至最大量程，并用75%乙醇清潔移液器，槍頭盒及超凈臺面。實驗進行的過程中或觀看實驗時，沒有帶口罩不 要在超凈臺前講話。二、總RNA抽提1）細胞培養(yǎng)皿中細胞樣品用1*PBS洗兩次后，用1ml槍將PBS吸干凈， 加入 1ml Trizol （ Inv

2、itrogen）溶液，吹打混勻，并吸至 1.5ml RNase free EP管中使細胞充分裂解，室溫靜置 5min；組織樣品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，混勻， 室溫放置5min使其充分裂解；（管蓋與管壁都需標記樣品名稱）2）加入200卩氯仿，劇烈振蕩混勻30s,使水相和有機相充分接觸，室溫 靜置3-5min；（離心時離心管按順序排放，離心完畢，離心管的順序 也按順序排好，與第一步的順序一致）3）4C下，14,000g離心15min，可見分為三層，RNA在上層水相，移 至另一個新的 RNase free EP管；（用20-200ul的槍吸取上清，吸上

3、清 時，槍頭應沿著液面上層吸取上清，槍頭不可碰到、吸到中間層）4） 沉淀RNA :加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻（顛倒6-8次）（丕 應用振蕩器混勻），室溫靜置10min；5）4C下，14,000g離心10min，收集RNA沉淀（如離心后仍不見 EP管 底部有沉淀，應將 EP管放置在-80度冰箱過夜，繼續(xù)在 4C下，14,000g 離心10min，收集RNA沉淀），去上清：6）用75%乙醇洗滌兩次（12,000g離心5min）（加入乙醇后只需輕輕顛 倒EP管即可，不用振蕩器震蕩或槍頭吸打沉淀），超凈臺風干；沉淀不 能過干或過濕，過干則不易溶解，過濕則乙醇殘留。7）視沉淀量加入適量DEPC水（

4、至少15ul）溶解沉淀。三、去基因組使用RNase-free的DNase ?（Promega），按以下體系配置反應液，37°C 消化 30min，65C 滅活 10min。RNA30DNase ?2010 x buffer10H2O(RNase free)39.5RNasi n0.5總體積100然后按以下步驟操作：1）加入等體積的苯酚/氯仿，上下顛倒混勻，室溫放置5min，后14,000rpm， 離心15mi n,取上清。2）加入等體積的氯仿，上下顛倒混勻，靜置分層后14,000rpm,離心15min， 取上清。3） 加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻（顛倒6-8 次） , -20C靜

5、置15min;4）4C下，14,000g離心15min，收集RNA沉淀，去上清；5）用75%乙醇洗滌兩次（12,000g離心5min），超凈臺風干；6）加入適量DEPC水（至少15ul）溶解沉淀。四、總RNA純度和完整性檢測1）純度檢測：取1卩l(xiāng) RNA樣品50倍稀釋，在核酸蛋白檢測儀上測定 OD值， OD260/OD280的比值大于1.8,說明制備的RNA較純，無蛋白質(zhì)污染。2）總RNA完整性檢測：取RNA樣品1門1 %瓊脂糖凝膠電泳80VX20min, EB染色10min，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，總 RNA的5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA條帶，三條條帶完整的話即可證明

6、總 RNA抽提比較完整。五、逆轉(zhuǎn)錄1. mRNA :1）在RNase free的PCR管中配置下列溶液.Total RNAH2O1.0pg pl總體積122）將上述溶液吹打均勻，置85C保溫5min,使RNA變性。隨后立即冰上致冷, 以防止RNA復性；3）在該PCR管中加入下列試劑（Promegaoligo (dT)0.5Ran dom primer0.510mM dNTP2.0RNase in hibitor0.5p5 x buffer4.0pM-MLV0.5p總體積8.0p4）將上述20卩反應溶液30C保溫10min;5）42 T 保溫 50min；6）85 T 保溫 10min；7）-2

7、0 C 保存。2. microRNA:使用莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄法,Step 2:Rea 1PCR Ftarwiaiij primerReversepriimer1）在去RNase的PCR管中配置以下溶液total RNAX個miR逆轉(zhuǎn)錄引物出01.00.5*XPg d總體積12.5pj2） 將上述溶液混勻，85C孵育5min，以打開RNA二級結(jié)構。隨后立即置于冰 上，以防止RNA復性再次恢復二級結(jié)構；3）在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液：10mM dNTP (promega)2.0RNase in hibitor (promega)0.5U6逆轉(zhuǎn)錄引物0.5d5x buffer4.0dM-ML

8、V (promega)0.5d總體積7.5d4）將3）溶液加入到1）溶液中，混勻后30C保溫10min；5）42C 孵育 50min;6）85E孵育10min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。四、定量PCR檢測1引物測試：根據(jù)mRNA設計的引物正式實驗前需進行qPCR測試其特異性和擴增效率， 具體反應體系和反應條件如正式實驗，每對引物需做模板水對照。得到結(jié)果后，首先根據(jù)熔解曲線判斷引物特異性， 選擇標準為：單峰且峰形 偏窄、水對照無明顯引物二聚體熔解曲線峰。 若設計的多對引物熔解曲線均顯示 特異性良好，則應對比各引物的擴增曲線，優(yōu)先選擇Ct值小、擴增效率高的引物進行正式實驗。2 確定上機內(nèi)容后，首先在記錄本上編排

9、好上機的樣品排放順序。（1） 一個樣品的加樣盡可能安排在同一行（2）如正式實驗中三次重復不能安排在同一板上， 則需把三次重復中的實驗分開，但同一次重復的實驗不能分開兩板3 正式實驗：體系配制:H2O4ulSYBR Green PCR Master Mix10ul （TOYOBO）（使用前需振蕩均勻）上游引物0.5ul(10uM)下游引物0.5ul(10uM)總體積15ul計算好實驗中需用多少份體系，則按具體量配置。體系分裝會有損失，一 般多配0.5份-1份體系?？偟捏w系配好后，在振蕩器中振蕩均勻或用槍吸打均勻，然后15ul每管分裝至8連管中。3. cDNA用滅菌純水稀釋適當?shù)臐舛?，一般?1:

10、20稀釋，如遇到基因表達低的 樣品，則適當降低稀釋比例至1:10或1:5。cDNA按一定順序排好后，即可加至 剛配好的反應體系中。加樣完畢，蓋好八連管蓋，并在八連管蓋最上沿的邊上標 記好1-12的順序（不可將標記寫在反應管的蓋子上，八連管蓋避免裸手觸摸中 間透明的熒光采集區(qū)域，且保證每孔均蓋緊，否則影響重復性或可能出現(xiàn)熔解曲 線峰漂移。）4 把各排八連管放在掌上離心機上離心數(shù)秒。五.上機：5.1先開電腦，進入 Windows界面。接著打開PCR儀電源開關。5.2打開7500軟件，選擇“新建”，在“ Template”下拉菜單中選擇“ 60”或“65” （普通基因檢測為“ 60”，MicroRNA檢測為“ 65”）5.3打開樣品架，放入八連管，關上樣品架，并在軟件上選擇已放反應管的孔位，剔除無反應管的孔位。5.4點擊File菜單中Save,輸入要保存結(jié)果的文件名，命名為日期-上機時間-客戶名字簡寫，如100830-1008-WL表示8月30日10點08分魏立的實驗。5.5點擊Start鍵，開始運行程序。5.6程序運行完畢后，取出