免疫組化SP法與SABC

1、ABC 法: ABC 代表的是親和素一生物素一過(guò)氧化物酶復(fù)合物。 利用抗生物素分 別 連接生物素標(biāo)記的第二抗和生物素標(biāo)記的酶。 但是此法注意內(nèi)源性生物素活性的 消除，以減少非特異性的染色。SP 法：是采用生物素標(biāo)記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的堿性磷酸酶 及底物色素混合液來(lái)測(cè)定細(xì)胞或組織中的抗原。PA 是一種金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁分離的蛋白質(zhì)，它能與各種動(dòng)物的 IGG 的 FC 段結(jié)合，在免疫組化中可作為橋 抗體或標(biāo)記抗體。最大的優(yōu)點(diǎn)是不受種屬的特異性 限制。此法還具有染色時(shí)間 短、靈敏度高、背景染色淡等優(yōu)點(diǎn)，分子量小，易于穿透組織。兩者本質(zhì)的區(qū)別是：SABC 法的“三抗”是 SABC 復(fù)

2、合物即鏈酶親和素-生物素- 過(guò)氧化物酶復(fù)合物；而 SP 法的“三抗”是過(guò)氧化物酶直接與鏈酶親和素相連的，沒(méi)有通過(guò)生物素的中介連接。SABC 步驟：切片常規(guī)脫蠟、脫 水；30% H2O 比蒸餾水 10 份混合，室溫 510 分鐘以滅活內(nèi) 源性酶，蒸餾水洗；將切片浸入 0.01M 枸櫞酸鹽（PH6.0）,微波爐加熱至沸騰 后斷 電，間隔 10 分鐘，反復(fù)兩次進(jìn)行熱修復(fù)抗原；滴加 5%BSA 封閉液，室溫 20 分鐘；滴加一抗，37C1小時(shí) 30 分鐘孵育；滴加生物素化山羊抗小鼠 IgG，室溫下 20 分鐘，PBS（ PH7.2 7.6 ）洗；滴加試劑 SABC 室溫下 20 分鐘，PBS 洗 5分

3、鐘X4次；DAB 顯色：取 1ml 蒸餾水，加試劑盒中 A，B，C 試劑各 1 滴，混 勻后加至切片，室溫顯色 18 分鐘；蘇木素輕度復(fù)染；脫水，透明封片。顯微鏡 下觀察。免疫組織化學(xué)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)， 是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原 位通過(guò)抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)， 對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、 定位、 定量 測(cè)定的一項(xiàng)新技術(shù)。 免疫組織化學(xué)的方法有多種， 其實(shí)都大同小異， 不同點(diǎn)只是 在于顯色基團(tuán)！SP 法1 ）脫蠟、水化；2）PBS 洗 23 次各 5 分鐘；3）3%HO （80 和醇）滴加在 TMA 上，室溫靜置 10 分鐘；4）PBS 洗 23 次各 5 分鐘；5）抗原修復(fù)

4、；6）PBS 洗 23 次各 5 分鐘；7）滴加正常山羊血清封閉液，室溫 20 分鐘。甩去多余液體。8）滴加I抗 50 卩 l，室溫靜置 1 小時(shí)或者 4C過(guò)夜或者 37C1小時(shí)。9） 4C過(guò)夜后需在 37C復(fù)溫 45 分鐘。10）PBS 洗 3 次各 5 分鐘；11）滴加U抗 4050 卩 I，室溫靜置，或 37C1小時(shí);12）II 抗中可加入 0.05%的 tween-20 。13）PBS 洗 3 次各 5 分鐘；14）DAB 顯色 510 分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度；15）PBS 或自來(lái)水沖洗 10 分鐘；16）蘇木精復(fù)染 2 分鐘，鹽酸酒精分化；17）自來(lái)水沖洗 1015 分鐘；18

5、）脫水、透明、封片、鏡檢。SABC 法I ）脫蠟、水化。2） PBS 洗兩次各 5 分鐘。3） 用蒸餾水或 PBS 配置新鮮的 3%HO，室溫封閉 510 分鐘，蒸餾水洗 3 次。4） 抗原修復(fù)。5） PBS 洗 5 分鐘。6） 滴加正常山羊血清封閉液，室溫 20 分鐘。甩去多余液體。7） 滴加I抗， 室溫 1 小時(shí)或者 4C過(guò)夜或者 37C1小時(shí) （4C過(guò)夜后在 37E復(fù)溫 45 分鐘）。8） PBS 洗三次每次 2 分鐘。9） 滴加生物素化二抗，20r37r20 分鐘。10）PBC 洗 3 次每次 2 分鐘。II）滴加試劑 SABC， 20r 37r20 分鐘。12）PBS 洗 4 次每次

6、 5 分鐘。13）DAB 顯色：DAB 顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）。14）蒸餾水洗。蘇木素復(fù)染 2 分鐘、鹽酸酒精分化。15）脫水、透明、封片、鏡檢。二者區(qū)別 ：sp 法是：一抗+生物素化二抗+ HRP 標(biāo)記的鏈霉卵白素（HRP 標(biāo)記的親和素）酶標(biāo)親和素-生物素技術(shù)（labelled avidin-biotintechnique，簡(jiǎn)稱 LAB 法）。即用辣根過(guò)氧化物酶直接標(biāo)記 avidin ，用 biotin 標(biāo)記 2 抗。關(guān)鍵步驟為 3 步：Ag +Ab1 + （Ab2-B） +A（A為 HRP 標(biāo)記的卵白素）A與 2 抗的生物素結(jié)合，avidin 起橋聯(lián)作用。如 將該

7、法中的卵白素（avidin ）變換成鏈霉卵白素 （streptavidin ），LAB 法即 成 LsAB法，或稱 SP 法。據(jù)認(rèn)為 LAB 法比 ABC 法敏感 24 倍，而 LsAB 法因 streptavidin不與組織細(xì)胞中內(nèi)源性生物素結(jié)合而特異性更高?，F(xiàn)在 SP 法已趨于取代 ABC 法而廣為應(yīng)用。sabc 法是：一抗生物素化二抗 abc 復(fù)合物（是使用前親和素與酶聯(lián)生物素現(xiàn) 配使用）親和素 - 生物素 - 過(guò)氧化物酶復(fù)合物技術(shù)（ avidin-biotin-peroxidase complextechnique，簡(jiǎn)稱 ABC 法）。關(guān)鍵的程序步驟為 3 步：Ag +Ab1 +（ A

8、b2-B）+AB C 復(fù)合物（Ab2-B 為生物素標(biāo)記的第二抗體）（B 為生物素標(biāo)記的過(guò)氧化物酶）ABC復(fù)合物是 avidin 與酶聯(lián) biotin 1 比 1 在使用前 30min 配置，混勻。 1 個(gè) avidin 分子結(jié)合了 3 個(gè) biotin 分子，剩下 1 個(gè)結(jié)合點(diǎn)與 2 抗的生物素結(jié)合， avidin 起 橋聯(lián)作用。ABC 法敏感性更高，比 PAP 法敏感 2040 倍，背景也更清晰。個(gè)人理解：SP 法和 SABC 法相差不大，一般都可以用.SP 法：一抗+ 生物素標(biāo)記二抗 + 辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素 + 辣根酶底物顯色SABC 法: 一抗+生物素標(biāo)記二抗+滴加試劑 SABC 鏈霉

9、卵白素+辣根酶標(biāo)記生物素）+辣 根酶底物顯色比較可知，SABC 法 SP 法在原理上基本是一樣的。但由于 SABC 法第 3 步有放大作用，所以更靈敏一些.可能會(huì)出現(xiàn)用 SABC 法可以做出結(jié)果的，用 SP 法做不出 來(lái).總的來(lái)說(shuō)，個(gè)人認(rèn)為 SABC 法可能好一些！我自己以及周?chē)耐瑢W(xué)以前一般都 是選用SABC 法！SP 法1 脫蠟水化2 蒸餾水中 5 分鐘3 用蒸餾水或 PBS 配置新鮮的 3%H2O2 室溫封閉 10 分鐘蒸餾水洗 1 次4 抗原修復(fù)5PBS 洗 5 分鐘6 滴加正常山羊血清封閉液 ,室溫 10 分鐘7 甩去多余液體滴加 1 抗 37 度 1 小時(shí)或者 4 過(guò)夜 4 過(guò)夜后

10、 37 復(fù)溫 45 分鐘8PBS 洗 2 次各 5 分鐘9 滴加生物素化抗孵育條件參見(jiàn)所用試劑盒10PBS11 滴加酶標(biāo)抗體孵育條件參見(jiàn)所用試劑盒12PBS 洗 2 次各 5 分鐘13DAB 顯色 510 分鐘在顯微鏡下掌握染色程度14 蒸餾水洗終止染色蘇木素復(fù)染鹽酸酒精分化1 5 脫水透明封片鏡檢洗 2 次各 5 分鐘SABC 法1 脫蠟水化2 蒸餾水中 5 分鐘3 用蒸餾水或 PBS 配置新鮮的 3%H2O2 室溫封閉 5-10 分鐘蒸餾水洗 1 次 4 抗原修復(fù)5PBS 洗 5 分鐘6 滴加正常山羊血清封閉液室溫 10-20 分鐘甩去多余液體7 滴加 1 抗,37 度 1 小時(shí)或者 4 過(guò)夜 4 過(guò)夜后在 37 復(fù)溫 30 分鐘8PBS 洗 2 次每次 5 分鐘9 滴加生物素化二抗孵育條件參見(jiàn)所用試劑盒10PBC 洗 2 次每次 5 分鐘11 滴加試劑 SABC 孵育條件參見(jiàn)所用試劑盒12PBS 洗 2 次每次 5