細(xì)胞工程—動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)節(jié)復(fù)習(xí)題1

1、動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)-技術(shù)細(xì)節(jié)1、原代培養(yǎng)：從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞為原代細(xì)胞。借助這種方法可以觀察細(xì)胞的分裂繁殖、細(xì)胞的接觸抑制、以及細(xì)胞的衰老，死亡等生命現(xiàn)象。2、傳代培養(yǎng)：將原代細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細(xì)胞懸浮液，分裝到兩個(gè)或兩個(gè)以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。3、無(wú)菌操作基本技術(shù): 3.1實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無(wú)菌室及無(wú)菌操作臺(tái)(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 %ethanol 擦拭無(wú)菌操作臺(tái)面，并開啟無(wú)菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘后，才開始實(shí)驗(yàn)操作。3.2每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。3.3實(shí)驗(yàn)完

2、畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以70 % ethanol 擦拭無(wú)菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無(wú)菌操作臺(tái)運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作。3.4無(wú)菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。3.5實(shí)驗(yàn)用品以70 % ethanol 擦拭后才帶入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在臺(tái)面中央無(wú)菌區(qū)域，勿在邊緣非無(wú)菌區(qū)域操作。 3.6小心取用無(wú)菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口

3、朝上放置桌面。 3.7工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于來(lái)自人類或是病毒感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃?jí)之無(wú)菌操作臺(tái)(至少Class II)。操作過(guò)程中，應(yīng)避免引起aerosol 之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。3.8定期檢測(cè)下列項(xiàng)目： CO2 鋼瓶的CO2 壓力CO2 培養(yǎng)箱的CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無(wú)菌水，每周更換)。 無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)之a(chǎn)irflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過(guò)濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng)，3000 小時(shí)/HEPA)。 4、培養(yǎng)基4.1 液體培養(yǎng)基貯存于4

4、冰箱，避免光照，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前放在37 水槽中溫?zé)帷?4.2 液體培養(yǎng)基(加血清) 存放期為六個(gè)月，期間谷氨酰胺可能會(huì)分解，若細(xì)胞生長(zhǎng)不佳，可以再添加適量谷氨酰胺。 4.3粉末培養(yǎng)基配制(注意)： 細(xì)胞培養(yǎng)基通常須添加10 % 血清、pH 為7.2 - 7.4。粉末培養(yǎng)基及NaHCO3 粉末應(yīng)分別溶解后才混合，然后用CO2 氣體調(diào)整pH，而非用強(qiáng)酸(HCl)或強(qiáng)堿(NaOH)，因?yàn)槁入x子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)可能有影響，且貯存時(shí)培養(yǎng)基的pH 易發(fā)生改變。純水配制。以0.1 或0.2 mm 無(wú)菌過(guò)濾膜過(guò)濾滅菌。標(biāo)示培養(yǎng)基種類、日期、瓶號(hào)等，貯存于4。須作生長(zhǎng)試驗(yàn)與污染測(cè)試。 5、抗生素 5.1. 細(xì)胞庫(kù)之細(xì)胞培

5、養(yǎng)基不加抗生素 5.1.1. 培養(yǎng)自ATCC 引進(jìn)之細(xì)胞株，培養(yǎng)基中不加抗生素。 5.1.2. 培養(yǎng)自其它實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)之細(xì)胞株，須添加抗生素，待token freeze 通過(guò)污染測(cè)試后，大量培養(yǎng)時(shí)則不加抗生素。 5.2. 寄送活細(xì)胞時(shí)，須將培養(yǎng)液充滿整個(gè)培養(yǎng)瓶時(shí)，則須添加抗生素(青霉素100 units/ml + 鏈霉素100 ug/ml)。 5.3. 若要檢測(cè)支原體，則培養(yǎng)基內(nèi)不可添加慶大霉素，因慶大霉素會(huì)抑制支原體生長(zhǎng)。6、血清：-20或70至4冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，一般以50 ml 無(wú)菌離心管可分裝4045 ml。在溶解過(guò)程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一

6、，減少沈淀的發(fā)生。勿直接由20直接至37解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沈淀。7. 血清之沈淀物 7.1. 凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin) 造成，這些凝絮沈淀物不會(huì)影響血清本身之品質(zhì)。7.2顯微鏡下觀察之“小黑點(diǎn)”：通常經(jīng)過(guò)熱處理的血清，沉淀物的形成會(huì)顯著的增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點(diǎn)”，一般而言，此小黑點(diǎn)應(yīng)不會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。8、細(xì)胞冷凍保存注意事項(xiàng)：8.1. 欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長(zhǎng)良好且存活率高之狀態(tài)，約為80 90 致密度。 8.2. 冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否仍

7、保有其特有性質(zhì)，例如hybridoma 應(yīng)在冷凍保存前一至二日測(cè)試是否有抗體之產(chǎn)生。 8.3. 注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO 應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，無(wú)菌且無(wú)色以510 ml 小體積分裝，4避光保存，勿作多次解凍。甘油亦應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因長(zhǎng)期儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性。 9、冷凍細(xì)胞活化：1.快速解凍（輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化），以避免冰晶重新結(jié)晶而對(duì)細(xì)胞造成傷害，導(dǎo)致細(xì)胞之死亡。2. 細(xì)胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細(xì)胞生長(zhǎng)或特性表現(xiàn)才會(huì)恢復(fù)正常(例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì))。解凍后是否立即去除冷凍保護(hù)劑(例如DMSO 或glycero

8、l)，依細(xì)胞種類而異，一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護(hù)劑。在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基大格*細(xì)胞總數(shù)x 2 x 104 / 4= 細(xì)胞數(shù)/ml1 冷凍管應(yīng)如何解凍？ 取出冷凍管后， 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化， 并注意水面不可超過(guò)冷凍管蓋沿， 否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)， 必須注意安全， 預(yù)防冷凍管之爆裂。2 細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)， 是否應(yīng)馬上去除DMSO？ 除少數(shù)特別注明對(duì)DMSO 敏感之細(xì)胞外， 絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞）， 在解凍之后， 應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中， 待隔天再置

9、換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)或貼附之問(wèn)題。 3 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？ 不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基， 若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基， 細(xì)胞大都無(wú)法立即適應(yīng)， 造成細(xì)胞無(wú)法存活。 4 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類？ 不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源， 所以血清的種類和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來(lái)自不同物種的血清， 在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無(wú)法存活。5 何謂FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine se

10、rum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯(cuò)誤的使用字眼， 請(qǐng)不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。 6 培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用5 % 或10% CO2？或根本沒(méi)有影響？ 一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng)， 而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的CO2 濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10 % CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時(shí)， 則應(yīng)使用5 % CO2

11、培養(yǎng)細(xì)胞。7 何時(shí)須更換培養(yǎng)基？ 視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定， 或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時(shí)間，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。 8 培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？ 除于特殊篩選系統(tǒng)中外， 一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下， 培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。 9 附著性細(xì)胞繼代時(shí)所使用之trypsin-EDTA 濃度？應(yīng)如何處理？ 一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA。第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中，保存于20 °C，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin 之活性降低， 并可減少污染之機(jī)會(huì)。 10 懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理？ 一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中

12、， 稀釋細(xì)胞濃度即可， 若培養(yǎng)液太多時(shí)， 可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高， 直到無(wú)法容納為止。分瓶時(shí)取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶， 加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度， 重復(fù)前述步驟即可。 11 欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來(lái)，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？ 欲回收動(dòng)物細(xì)胞， 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm)，5 - 10 分鐘， 過(guò)高之轉(zhuǎn)速， 將造成細(xì)胞死亡。 12 細(xì)胞之接種密度為何？ 依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)之一重要原因。 13 細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？ 動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 -

13、10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能， 故不可將DMSO 直接加入細(xì)胞液中， 必須使用前先行配制完成。14 DMSO 之等級(jí)和無(wú)菌過(guò)濾之方式為何？ 冷凍保存使用之DMSO 等級(jí)， 必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即為無(wú)菌狀況， 第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中， 保存于4°C， 避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì)， 并可減少污染之機(jī)會(huì)。若要過(guò)濾DMSO， 則須使用耐DMSO 之

14、Nylon 材質(zhì)濾膜。15 冷凍保存細(xì)胞之方法？ 冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 3060 分鐘 (-20 °C30 分鐘*) -80 °C 1618 小時(shí)(或隔夜) 液氮槽vaporphase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。 冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 °C 至80 °C 以下， 再放入液氮槽vapor phase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。*-20 °C 不可超過(guò)1 小時(shí)， 以防止冰晶過(guò)大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。適用于懸浮型細(xì)胞之保存。16 細(xì)胞欲冷凍

15、保存時(shí)， 細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？ 冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為每瓶1x106 cells/ml， 融合瘤細(xì)胞則以每瓶5x106 cells/ml 為宜。 17 應(yīng)如何避免細(xì)胞污染？ 細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因?yàn)闊o(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等。嚴(yán)格之無(wú)菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好方法。 18 如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時(shí)，應(yīng)如何處理？ 加入相應(yīng)抗生素。直接滅菌后丟棄之。 19 支原體(mycoplasma) 污染的細(xì)胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？ 不能。除極有經(jīng)驗(yàn)之專家外，大多數(shù)遭受支

16、原體污染的細(xì)胞株，無(wú)法以其外觀分辨之。 20 支原體污染會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響？ 支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長(zhǎng)參數(shù)， 代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free，實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。 21 偵測(cè)出細(xì)胞株有支原體污染時(shí)， 該如何處理？ 直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細(xì)胞株。 22 CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？ 定期(至少每?jī)芍芤淮? 以無(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌去離子水更換之。 23 為何培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中， 顏色會(huì)偏暗紅色， 且pH值會(huì)越來(lái)越偏堿性？ 培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中， 培養(yǎng)基內(nèi)之CO2 會(huì)逐漸溢出，造成培養(yǎng)基

17、越來(lái)越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果， 將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí)， 可以通入無(wú)菌過(guò)濾之CO2， 以調(diào)整pH 值。 24 各種細(xì)胞培養(yǎng)用的dish，flask是否均相同？ 不同廠牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 雖對(duì)大部分細(xì)胞沒(méi)有太大之影響， 惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長(zhǎng)差異。25 購(gòu)買之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形？ 研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少， 大都是因?yàn)殡x心過(guò)

18、程操作上的失誤， 造成細(xì)胞的物理性損傷， 以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心， 應(yīng)待細(xì)胞生長(zhǎng)隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。 26 購(gòu)買之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因？ 研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳， 常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過(guò)程錯(cuò)誤。冷凍細(xì)胞解凍后， 加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤。細(xì)胞置于80 °C 太久。 27 收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因？ 冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因?yàn)椴僮髡邐A取冷凍管時(shí)用力不當(dāng)，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松

19、動(dòng)或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時(shí)，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊 28 如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基？ 培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒(méi)有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長(zhǎng)。總之，首選MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，無(wú)血清培養(yǎng)最好首選AIM V（12005）培養(yǎng)基（SFM）。 29 L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？ L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來(lái)源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后會(huì)降解

20、，但是確切的降解率一直沒(méi)有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。 30 GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I？這個(gè)二肽有多穩(wěn)定？ GlutaMAX-I 二肽是一個(gè)L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來(lái)保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。 31 什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？ 酚紅在培養(yǎng)基中被用來(lái)作為PH值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為

21、紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測(cè)，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基32 培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？ 丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒(méi)有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。34二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的是什么？ 二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來(lái)螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞，以消除來(lái)自培養(yǎng)基中所有

22、的二價(jià)離子。 33目錄上說(shuō)，Hanks 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用，不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么？Hanks 平衡鹽溶液(HBS)和Earles平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別？HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會(huì)變堿，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagles液，。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織，用Hanks液就可以了。35當(dāng)在無(wú)血清培

23、養(yǎng)基中添加抗生素時(shí)，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。血清蛋白會(huì)結(jié)合和滅活一些抗生素。在無(wú)血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對(duì)于細(xì)胞達(dá)到毒性水平。 36 一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí)，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_始降解。 37 大部分添加物和試劑最多可以凍融3次，如果次數(shù)更多都會(huì)在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會(huì)影響它的性能。 38 在溶解的一周內(nèi)使用貯存在4冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4就可能開始降解，如果在室溫下放置超過(guò)30分鐘，就會(huì)變得不穩(wěn)定。 1. 保存血清最好的方法?建議血清應(yīng)保存在-5至-2O。然

24、而，若存放于4時(shí)，請(qǐng)勿超過(guò)一個(gè)月。若您一次無(wú)法用完一瓶，建議您無(wú)菌分裝血清至恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi)，再放回冷凍。2. 如何解凍血清才不會(huì)使產(chǎn)品質(zhì)量受損?建議您將血清從冷凍箱取出后，先置于28冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過(guò)程中必須規(guī)則地?fù)u晃均勻。3. 血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理?血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后，也會(huì)存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質(zhì)量。若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無(wú)菌離心管內(nèi)，以400g稍微

25、離心,上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過(guò)濾。我們不建議您以過(guò)濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因?yàn)樗赡軙?huì)阻塞您的過(guò)濾膜。4. 為什么要熱滅活血清?加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在免疫學(xué)研究，培養(yǎng)ES細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。5. 有必要做熱滅活嗎?實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)過(guò)正確處理的熱滅活血清，對(duì)大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過(guò)的血清對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)只有微小的促進(jìn)，或完全沒(méi)有任何作用，甚至通常因?yàn)楦邷靥幚碛绊懥搜宓馁|(zhì)量，而造成細(xì)胞生長(zhǎng)速率的降低。而經(jīng)過(guò)熱處理的血清，沉淀物的形成會(huì)顯著的增多，這些沉淀物在

26、倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點(diǎn)”，常常會(huì)讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37環(huán)境中，又會(huì)使此沉淀物更增多，使研究者誤認(rèn)為是微生物的分裂擴(kuò)增。 6. 為什么儲(chǔ)存在冰箱中的胎牛血清會(huì)出現(xiàn)沉淀?GIBICO的胎牛血清 沒(méi)有預(yù)老化，儲(chǔ)存在28時(shí)，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應(yīng)該不會(huì)影響血清的質(zhì)量。推薦在20儲(chǔ)存胎牛血清，避免反復(fù)凍融。7. 如何避免血清中沉淀物的產(chǎn)生?解凍血清時(shí)，請(qǐng)按照所建議的逐步解凍法(-20至4至室溫)，若血清解凍時(shí)改變的溫度太大(如-20至37)，實(shí)驗(yàn)顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物。解凍血清時(shí)，請(qǐng)隨

27、時(shí)將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。請(qǐng)勿將血清置于37太久。若在37放置太久，血清會(huì)變得混濁，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會(huì)因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無(wú)須做此步驟。若必須做血清的熱滅活，請(qǐng)遵守56，30分鐘的原則，并且隨時(shí)搖晃均勻。溫度過(guò)高，時(shí)間過(guò)久或搖晃不均勻，都會(huì)造成沉淀物的增多。8細(xì)胞凍存復(fù)蘇原則：慢凍快融當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：1)細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。 2)如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶。大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器損傷和破裂。3)復(fù)蘇過(guò)程

28、應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。細(xì)胞的凍存 冷凍保護(hù)劑：冷凍保護(hù)劑是指可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì)。一般只有紅細(xì)胞、大多微生物和極少數(shù)有核的哺乳動(dòng)物細(xì)胞凍存時(shí)可不加冷凍保護(hù)劑；但對(duì)大多數(shù)有核哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)說(shuō)，冷凍時(shí)必須加冷凍保護(hù)劑。滲透性冷凍保護(hù)劑：甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、甲醇等小分子， 其保護(hù)機(jī)制是在細(xì)胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷。非滲透性冷凍保護(hù)劑：主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚 乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羥乙基淀粉等大分子物質(zhì)。其保護(hù)機(jī)

29、制的假說(shuō)很多，其中有一種是，減少冰晶的形成。冷凍保存溫度 :液氮溫度（-196）是目前最佳的冷凍保存溫度。在-196 時(shí)，細(xì)胞的生命活動(dòng)幾乎完全停止，但復(fù)蘇后細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能完好。如果冷凍過(guò)程得當(dāng)，一般生物樣品在-196 下均可保存十年以上。 -70-80 保存細(xì)胞，短期內(nèi)對(duì)細(xì)胞的活性無(wú)明顯影響，但隨著凍存時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率明顯降低。在冰點(diǎn)到-40 范圍內(nèi)保存細(xì)胞的效果不佳。note:甘油和DMSO并不防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰，在使用該類冷凍保護(hù)劑時(shí)，需要一定的時(shí)間進(jìn)行預(yù)冷，讓其滲透到細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)外達(dá)到平衡以起到充分的保護(hù)作用。DMSO在常溫下對(duì)細(xì)胞的毒性作用較大，而在4時(shí)，其毒性作用大大減弱，且仍

30、能以較快的速度滲透到細(xì)胞內(nèi)。所以，凍存時(shí)DMSO平衡多在4下進(jìn)行，一般需要4060分鐘。9. 細(xì)胞株運(yùn)輸：1 )貼身運(yùn)輸：短途運(yùn)輸，挑選的生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞裝滿培養(yǎng)基，將瓶口用酒精棉球擦拭遍，將瓶蓋擰緊，酒精消毒后用封口膜封閉，整個(gè)瓶子外表面噴上酒精，用塑料手套包裹后，豎力貼身放置（或者比較溫暖的地方），運(yùn)輸途中盡量避免劇烈震蕩（避免培養(yǎng)基與瓶口接觸）細(xì)胞取回后，半量換液（保留吸出的大部分的培養(yǎng)基，以備以后半量換液用）2 )冰瓶運(yùn)輸：短途運(yùn)輸，從液氮中取出細(xì)胞，放入冰盒中轉(zhuǎn)運(yùn)至新的實(shí)驗(yàn)室。3 )液氮罐運(yùn)輸：短途及長(zhǎng)途運(yùn)輸，從液氮中取出細(xì)胞，放入裝滿液氮的小型液氮罐中轉(zhuǎn)運(yùn)至新的實(shí)驗(yàn)室10.收到T25 培養(yǎng)瓶包裝細(xì)胞， 處理方式為： 1. 寄送過(guò)程中，為避免起泡造成細(xì)胞脫落死亡，T25 培養(yǎng)瓶均加滿培養(yǎng)基。收到后應(yīng)檢查培養(yǎng)瓶外觀，并于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和有無(wú)污染現(xiàn)象，若