一個(gè)新的小麥非生物脅迫誘導(dǎo)基因的克隆及表達(dá)特性

1、一個(gè)新的小麥非生物脅迫誘導(dǎo)基因的克隆及表達(dá)特性張瑞越1,2，徐兆師1，李連城1，陳 明1，馬有志1(1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)部作物遺傳育種重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，北京100081；2江蘇淮陰師范學(xué)院生物系，淮安223300)摘要：【目的】水分脅迫和低溫是制約植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要限制因子，研究植物感知、傳遞脅迫信號(hào)，并對(duì)重要的基因進(jìn)行克隆對(duì)改良作物的抗性有重要意義。本試驗(yàn)的目的是克隆與水分脅迫相關(guān)的基因，通過(guò)基因的功能進(jìn)一步了解植物的抗旱機(jī)制，并為抗逆育種提供候選基因?！痉椒ā吭囼?yàn)應(yīng)用噬菌體原位雜交技術(shù)從小麥旱脅迫cDNA文庫(kù)中克隆了一個(gè)水分脅迫誘導(dǎo)基因片段W89。用5-RACE和RT-PCR

2、方法，獲得了W89基因的全長(zhǎng)序列?！窘Y(jié)果】W89全長(zhǎng)cDNA為2 392 bp，其中，編碼區(qū)長(zhǎng)1 896 bp，編碼631個(gè)氨基酸。Southern雜交表明，W89是一個(gè)單拷貝基因。RT-PCR結(jié)果表明，W89受干旱、低溫和ABA的誘導(dǎo)。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)W89有一個(gè)DUF248保守區(qū)（pfam03141），包含一個(gè)具有SAM （Sterile Alpha Motif）結(jié)合基序的甲基轉(zhuǎn)移酶區(qū)。同源性分析發(fā)現(xiàn)W89與一個(gè)水稻干旱誘導(dǎo)蛋白（BAD67956）的同源性為66%，推測(cè)W89可能是一個(gè)新的小麥干旱誘導(dǎo)的基因?！窘Y(jié)論】根據(jù)甲基轉(zhuǎn)移酶和SAM結(jié)合基序的功能，推測(cè)W89的SAM結(jié)合基序可能與其

3、它蛋白或轉(zhuǎn)錄因子相互作用調(diào)控植物脅迫基因的表達(dá)，并且可能在干旱脅迫的早期調(diào)控信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。關(guān)鍵詞：小麥；水分脅迫；低溫；基因克隆 Cloning and Expression Analysis of a Novel Abiotic Stress-induced Wheat Genes ZHANG Rui-yue1,2, XU Zhao-shi1, LI Lian-cheng1, CHEN Ming1, MA You-zhi1(1 Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding, Ministry of Agriculture, Institute of

4、Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081; 2 Agricultural College, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052)Abstract: 【Objective】Water stress and cold stress are important factors restricting plant growth. However, there is little knowledge on the function of str

5、ess-responsive genes in plant. Therefore, it is necessary to clone some important genes to study the mechanism of plant adaptation to abiotic stress for the improvement of plant resistance. Our objective is the cloning of water stress-related genes, and providing candidate genes for stress-resisted

6、plant breeding. 【Method】A putative water stress-induced gene, W89, was cloned from the cDNA library of drought-treated wheat seedlings by phage hybridization in situ. Its entire length was obtained using 5-rapid amplification of cDNA ends (RACE) and reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RT

7、-PCR). 【Result】The full-length cDNA of W89 consists of 2 392 bp and contains a 1 896 bp open reading frame (ORF) encoding a 631 amino acid protein. Southern blot analysis indicated that W89 was a single-copy gene. RT-PCR analysis revealed that the expression of W89 was unregulated by drought, cold a

8、nd abscisic acid (ABA). Amino acid sequence analysis discovered that W89 had a conserved region of DUF248 (pfam03141), which contained a methyltransferase domain with a sterile alpha motif (SAM)-binding motif. Phylogenetic analysis showed that W89 was 66% identical to Oryza sativa dehydration-respon

9、sive protein (BAD67956). It was supposed that W89 was a novel dehydration-responsive protein encoding gene. 【Conclusion】Based on the functions of methyltransferase and SAM-binding motif, the SAM-binding motif of W89 was supposed to be connected with other proteins or transcription factors to transdu

10、ce stress signals and finally regulate the expression of stress-responsive genes on the early stage of drought stress. Key words: Wheat; Water stress; Cold; Gene cloning 0 引言【研究意義】干旱可直接導(dǎo)致細(xì)胞缺水，高鹽、低溫脅迫可改變植物體內(nèi)滲透平衡，導(dǎo)致植物吸水困難。研究植物感知、傳遞脅迫信號(hào)，并對(duì)重要的基因進(jìn)行克隆對(duì)進(jìn)一步了解植物的抗旱機(jī)制和改良作物的抗性有重要意義。【前人研究進(jìn)展】植物細(xì)胞缺水引起一系列生理生化變化，如物

11、質(zhì)代謝失調(diào)、活性氧增多、代謝毒物積累等1,2。水分脅迫還可改變植物內(nèi)源激素的平衡，減少促進(jìn)生長(zhǎng)的激素，增加抑制或延緩生長(zhǎng)的激素，從而抑制植物的生長(zhǎng)發(fā)育3。在逆境脅迫條件下，植物細(xì)胞感知并傳遞脅迫信號(hào)，引發(fā)一系列生理、生化反應(yīng)來(lái)維持自身的水分狀況，避免或減輕缺水對(duì)細(xì)胞造成的危害4。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多基因的表達(dá)受干旱、低溫和高鹽脅迫的誘導(dǎo)，產(chǎn)生一些重要的功能蛋白和調(diào)控蛋白，來(lái)維持細(xì)胞各種代謝活動(dòng)的正常進(jìn)行46。在干旱狀態(tài)下，大豆LEA蛋白（GmPM16）與糖相互作用形成緊密的玻璃狀基質(zhì)減少細(xì)胞的損 傷7，豌豆LEA蛋白（PsLEAm）可保護(hù)線粒體基質(zhì)酶（如延胡索酸酶和硫氰酸酶）8。水通道蛋白可幫助水分通

12、過(guò)細(xì)胞膜，對(duì)擬南芥質(zhì)膜水通道蛋白PIPs突變體研究發(fā)現(xiàn)，在正常和干旱狀態(tài)下，突變體和對(duì)照沒(méi)有明顯的差別，但復(fù)水后對(duì)照的電導(dǎo)率、蒸騰速率和葉片水勢(shì)都明顯高于突變體，表明PIPs對(duì)植物干旱脅迫后的恢復(fù)起重要作用9。調(diào)控蛋白如轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶等，在脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)調(diào)控過(guò)程中起重要作用3, 4, 10。從擬南芥中分離的AREB1和AREB2受旱、高鹽和ABA誘導(dǎo)，激活啟動(dòng)子區(qū)含有ABRE元件的基因的表達(dá)，如RD22、AtADH等11。水稻OsDREBL受低溫誘導(dǎo)，但不受ABA、鹽和干旱誘導(dǎo)12；小麥TaDREB1受低溫、鹽和旱誘導(dǎo)，它們調(diào)控具有DRE元件的基因的表達(dá)13。蛋白激酶參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的

13、新陳代謝、轉(zhuǎn)錄和對(duì)各種刺激產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)等。CIPK3受低溫、鹽和ABA誘導(dǎo)表達(dá)14，CDPK可激活脅迫誘導(dǎo)基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物抗性15。對(duì)模式植物擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)38種功能基因與脫水應(yīng)答有關(guān)16，在水分脅迫下存在著兩種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，即ABA依賴型和非依賴型1, 5。這兩種途徑可能在下游信號(hào)的識(shí)別和轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中共存，擬南芥RD29A的表達(dá)在干旱脅迫的最初幾小時(shí)不依賴于ABA，但在后期階段卻依賴于ABA2, 17。【本研究的切入點(diǎn)】植物的水分脅迫應(yīng)答涉及極為復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。目前對(duì)有關(guān)水分脅迫誘導(dǎo)基因的功能了解不多，植物的抗旱機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究?？寺∨c水分脅迫相關(guān)的基因?qū)ρ芯恐参锏乃置{迫適應(yīng)機(jī)理以

14、及提高對(duì)水分脅迫的抗性有重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】筆者從小麥的cDNA文庫(kù)中克隆了一個(gè)與水分脅迫相關(guān)的基因W89，RT-PCR結(jié)果表明，W89受干旱、低溫和ABA的誘導(dǎo)。該基因的克隆為水分脅迫育種提供候選基因。1 材料與方法1.1 材料將普通小麥品種小白麥播種在苗床上，2024生長(zhǎng)10 d左右后進(jìn)行各種處理，處理時(shí)間分別為2 h、5 h和10 h。將小麥幼苗置于4培養(yǎng)箱進(jìn)行低溫處理；置于2%的NaCl溶液中進(jìn)行鹽處理；將水培的小麥幼苗取出吸干水分，置于干燥的濾紙上進(jìn)行干旱處理；用200 molL-1的ABA溶液噴施小麥幼苗進(jìn)行ABA處理。1.2 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及W89全長(zhǎng)cDNA的克隆

15、采用生長(zhǎng)10 d左右的小白麥幼苗干旱處理2 h后，用Poly(A) Quik mRNA Isolation Kit（Stratagene）分離mRNA，按Stratagene公司的HybriZAP-2.1 XP Library Construction Kit和HybriZAP-2.1 XP cDNA Synthesis Kit 構(gòu)建cDNA文庫(kù)。庫(kù)容量為10106 pfu。用噬菌體原位雜交技術(shù)進(jìn)行cDNA文庫(kù)的篩選，65雜交12 h以上，用洗脫液（2SSC/0.5% SDS）65洗2次，每次15 min，將獲得的陽(yáng)性克隆測(cè)序。結(jié)合5-RACE和RT-PCR方法，獲得了第89號(hào)克隆的全長(zhǎng)cDN

16、A序列，命名為W89，GenBank注冊(cè)號(hào)為AY987028。1.3 同源性分析通過(guò)檢索GenBank和利用DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比較和同源性分析。1.4 Southern雜交應(yīng)用SDS-酚氯仿法提取小麥基因組DNA，分別用BamHI、EcoRV和EcoRI37過(guò)夜酶切等量DNA（每泳道10 g DNA），用0.8%的瓊脂糖膠電泳分離后轉(zhuǎn)到尼龍膜上。用-32P-dCTP標(biāo)記的W89基因的3端（PCR擴(kuò)增獲得，長(zhǎng)度370 bp）作為探針進(jìn)行Southern雜交，用洗液（2SSC/0.1% SDS）65洗脫后，壓X-光片。1.5 半定量RT-PCR分析從不同脅迫處理的小麥材料中提取總RNA。

17、取1 g總RNA作為模板進(jìn)行RT-PCR，所用引物為89RTF: 5-TCAGCATCTACCAGGACAGGTG-3，89RTR：5-CATCGCGTCACACCTAGTTACC-3。擴(kuò)增條件為：942 min，94 30 s，60 45 s，72 45 s，30個(gè)循環(huán)，72 7 min。以Actin基因作為內(nèi)標(biāo)。2 結(jié)果與分析2.1 W89全長(zhǎng)cDNA的克隆和同源性分析利用噬菌體原位雜交技術(shù)，從干旱誘導(dǎo)的小麥cDNA噬菌體文庫(kù)中篩選到1個(gè)1 059 bp 的cDNA克隆W89。用5-RACE和RT-PCR方法，獲得了W89基因的全長(zhǎng)序列。W89全長(zhǎng)cDNA為2 392 bp，其中編碼區(qū)長(zhǎng)1

18、 896 bp，編碼631個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量約為71.79 kD，等電點(diǎn)為7.67。5非編碼區(qū)為160 bp，3非編碼區(qū)為336 bp（圖1）。在GenBank搜索比對(duì)發(fā)現(xiàn)W89有1個(gè)DUF248保守區(qū)（pfam03141，460669 AA），DUF248保守區(qū)通常由幾個(gè)串聯(lián)序列組成甲基轉(zhuǎn)移酶區(qū)，有些甲基轉(zhuǎn)移酶區(qū)包含1個(gè)SAM結(jié)合基序18, 19。W89包含SAM結(jié)合基序，據(jù)報(bào)道，SAM結(jié)合基序在蛋白與蛋白互作中起重要的作用25。從GenBank中搜索到5個(gè)與W89氨基酸序列同源性較高的蛋白。用DNAMAN軟件分析結(jié)果顯示，W89與1個(gè)水稻旱誘導(dǎo)蛋白（BAD67956）的同源性為66%（圖

19、2），推測(cè)W89是1個(gè)新的小麥旱誘導(dǎo)基因。2.2 Southern雜交分析為了檢測(cè)W89基因的拷貝數(shù)，分別用BamHI、EcoRV和EcoRI酶切小麥基因組DNA，以-32P-dCTP標(biāo)記W89基因的3端作為探針進(jìn)行了Southern雜交。雜交結(jié)果顯示BamHI、EcoRV和EcoRI酶切的DNA泳帶都各有一條雜交帶（圖3）。因此，推測(cè)W89基因是一個(gè)單拷貝基因。2.3 W89的表達(dá)特性分析采用RT-PCR法檢測(cè)W89在不同脅迫條件下的表達(dá)特性。結(jié)果表明，W89在不同處理?xiàng)l件下的表達(dá)水平是不同的（圖4）。當(dāng)用ABA處理后，W89的表達(dá)量逐漸增大，到5 h達(dá)最高水平而后逐漸減少。在干旱處理下，W

20、89在2 h表達(dá)最強(qiáng)，而后逐漸降低；在低溫處理下，W89表達(dá)逐漸增強(qiáng)到5 h達(dá)最高，隨后表達(dá)量降低。W89的轉(zhuǎn)錄水平不受高鹽的影響。因此，W89是一個(gè)依賴于受干旱、低溫和ABA調(diào)控的基因。3 討論 DNA甲基化在植物的發(fā)育和分化中起著調(diào)控基因表達(dá)的作用。甲基轉(zhuǎn)移酶可以通過(guò)催化DNA的GC二核苷酸胞嘧啶的第5位碳原子的甲基化來(lái)抑制或關(guān)閉基因的表達(dá)20。在環(huán)境脅迫下，植物調(diào)節(jié)甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，能夠更高效地修復(fù)環(huán)境脅迫引起的蛋白質(zhì)損傷21。將肌醇O-甲基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)入煙草中提高了植株的抗旱耐鹽能力，并且轉(zhuǎn)基因植株脅迫后的恢復(fù)速度要比野生型植株快22。在干旱、高鹽和ABA處理下，小麥的天冬氨酰異構(gòu)甲基轉(zhuǎn)移

21、酶在小麥幼苗中被誘導(dǎo)激活21。小麥的N-甲基轉(zhuǎn)移酶和黑麥的O-甲基轉(zhuǎn)移酶都受低溫的調(diào)控23, 24。分析發(fā)現(xiàn)W89內(nèi)部的甲基轉(zhuǎn)移酶區(qū)包含一個(gè)SAM結(jié)合基序。SAM結(jié)合基序存在于許多真核調(diào)節(jié)蛋白中，如酪氨酸激酶、絲氨酸/蘇氨酸激酶、轉(zhuǎn)錄因子等，是蛋白相互作用的位點(diǎn)，多個(gè)蛋白亞基通過(guò)SAM結(jié)合基序相互作用形成聚合體，調(diào)控信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)錄抑制25。由此推測(cè)W89基因的SAM結(jié)合基序可能與其它蛋白或轉(zhuǎn)錄因子相作用，調(diào)控植物在逆境中的基因表達(dá)，提高植物的抗逆性。許多基因能被ABA、干旱、高鹽和低溫同時(shí)或某幾個(gè)脅迫因子誘導(dǎo)表達(dá)。RD29A可同時(shí)被ABA、干旱、高鹽和低溫誘導(dǎo)4, 17；CBF1、CBF2、

22、CBF3被低溫誘導(dǎo)，不受ABA和干旱的誘導(dǎo)；而CBF4受干旱和ABA的誘導(dǎo)，卻不受低溫的誘導(dǎo)26, 27。有人將擬南芥ABA應(yīng)答基因劃分成9類：細(xì)胞分裂與增殖、細(xì)胞保護(hù)、防衛(wèi)與衰老、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞組織與起源、能量與新陳代謝、蛋白質(zhì)合成、轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)移激活和功能未知基因28。依據(jù)基因?qū)γ撍{迫反應(yīng)的時(shí)間可劃分為二類，一類是脅迫發(fā)生后迅速反應(yīng)，一類是脅迫發(fā)生后需一段時(shí)間后才反應(yīng)。推測(cè)早期應(yīng)答基因可能起保護(hù)細(xì)胞及擴(kuò)大信號(hào)的作用，而后期應(yīng)答基因可能起使植物適應(yīng)脅迫狀態(tài)的作用6。Seki等分析旱誘導(dǎo)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)一類基因在干旱處理后2 h表達(dá)最強(qiáng)而后逐漸降低，如Rd22BP1、DREB2A，這些基因可

23、能調(diào)控信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物對(duì)脅迫的耐受能力2。低溫脅迫通常伴隨著脫水脅迫。并且，許多低溫誘導(dǎo)基因?qū)Ω珊岛虯BA也發(fā)生響應(yīng)10, 17。根據(jù)W89在干旱脅迫下的表達(dá)特征（圖4），推測(cè)W89可能在早期干旱脅迫下調(diào)控信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)；而低溫也誘導(dǎo)了W89的表達(dá)，可能是低溫引起植物生理干 1 CGCTCGCGTGAATAAATAGCGCCTCACTGCCCGGACCGGAGCTCGGGCTCACCGGAGACGCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTTCTTCAT 91 CCGTCCCGGCGCGCTGAGCTCCTACCCAGGAGAGGAGAGGAGGACGGCTTCTTCCCGACG

24、GACAGGAGCCATGGCTAAAGATTACCCAGC 1 M A K D Y P A 181 ATCTCCTAAAGCCCAGCATCTGCAAGAATCCAAGAAGCAGCGTCTCACCTACGTACTTGTGGTGAGCGCTCTCTGCGTTGCCTTCTACGT 8 S P K A Q H L Q E S K K Q R L T Y V L V V S A L C V A F Y V 271 GCTCGGGGCATGGCAGAACAGCACCATGCCGAATCCTGTGGCTGATTCGGCAATCAGCCGAGTCGACTGTGATACCGTGGCGCAGAGAGA 3

25、8 L G A W Q N S T M P N P V A D S A I S R V D C D T V A Q R D 361 CGGCTCGGTGCCGTCTTTTGCGCCTGCATCTGAGAATGTGCTCGATTTTGATGCGCACCACCAGCTGAACCTCAGTGAGACAGAGTCTGT 68 G S V P S F A P A S E N V L D F D A H H Q L N L S E T E S V 451 GGTGCAGCAGTTCCCTGCGTGCCCGCTCAATCAGAGTGAGTACACGCCATGCGAGGACCGGAAACGTGGCCGTCTG

26、TTTGACCGGGACAT 98 V Q Q F P A C P L N Q S E Y T P C E D R K R G R L F D R D M 541 GCTGATATACCGTGAGAGGCACTGCCCGGGCAAGGACGAGCAGATCCGATGCCTCATTCCAGCGCCACCAAAGTACAAGAACCCCTTCAG 128 L I Y R E R H C P G K D E Q I R C L I P A P P K Y K N P F R 631 GTGGCCGGAGAGCAGGGACGTCGCTTGGTTTGACAACATCCCTCACAAGGAGCTCAGCA

27、TTGAGAAGGCCGTGCAGAACTGGATCCGAGT 158 W P E S R D V A W F D N I P H K E L S I E K A V Q N W I R V 721 GGAGGGGAACAAGTTCCGGTTCCCCGGTGGTGGCACTATGTTTCCCCATGGCGCTGACGCGTACATTGATGAAATCAGTAAGCTCATCTC 188 E G N K F R F P G G G T M F P H G A D A Y I D E I S K L I S 811 GTTGTCGGATGGGAGGATCAGGACGGCGATCGACACGGGCT

28、GCGGGGTTGCTAGCTTTGGGGCTTACTTGCTGAAGAGGAACATCATTAC 218 L S D G R I R T A I D T G C G V A S F G A Y L L K R N I I T 901 CGTGTCGTTTGCGCCGAGGGACACACACGAAGCTCAGGTGCAATTTGCACTGGAACGTGGTGTGCCTGCCATCCTCGGGGTGATGGGATC 248 V S F A P R D T H E A Q V Q F A L E R G V P A I L G V M G S 991 AATACGGTTGCCTTATCCATCTA

29、GGGCATTTGATCTGGCTCATTGTTCACGTTGTCTGATTCCTTGGGGAGGACATGATGGACTGTACCT 278 I R L P Y P S R A F D L A H C S R C L I P W G G H D G L Y L 1081 TGCCGAGATCGATAGAATTCTAAGGCCAGGGGGCTACTGGATTCACTCGGGCCCTCCGATCAACTGGAAGACGCACCACAATGGGTGGAA308 A E I D R I L R P G G Y W I H S G P P I N W K T H H N G W K 1171 GAGG

30、GCCGAGGAAGACCTCAAGCGGGAGCAAGACAAGATTGAGGATGTCGCGAGGAGCCTTTGCTGGAATAAGGTGGCCGAGAAGGAGGA338 R A E E D L K R E Q D K I E D V A R S L C W N K V A E K E D 1261 TCTCTCCATCTGGCAGAAGCCCAAGAACCACCTTGAGTGTGCCGACATAAAAAAGAAGCATAAGATACCCCATATCTGCAAGAGTGACAA368 L S I W Q K P K N H L E C A D I K K K H K I P H I C

31、 K S D N 1351 CCCTGATGCTGCCTGGTACAAGAAGATGGAATCCTGTCTTACTCCATTGCCTGAAGTAAGCAACCAGGGATCAATCGCCGGCGGAGAGGT398 P D A A W Y K K M E S C L T P L P E V S N Q G S I A G G E V 1441 TGCGAGATGGCCAAAGAGGGCATTCACGGTGCCCCCAAGGGTTAAGAGGGGCACGATTCCGGGGATAGATGAAAAGAAGTTTGAGGATGA428 A R W P K R A F T V P P R V K R G

32、 T I P G I D E K K F E D D 1531 CATGAAGCTGTGGGAGAAGAGGTTGGCGTACTACAAACGCACCACGCCCATAGCACAGGGGAGGTACAGGAATGTGATGGACATGAATGC458 M K L W E K R L A Y Y K R T T P I A Q G R Y R N V M D M N A 1621 GAACTTGGGCGGTTTTGCCGCTTCCCTGGTTAAGTACCCTGTGTGGGTGATGAACGTCGTTCCAGTTAATTCGGATAAAGACACCCTTGG488 N L G G F A A S

33、 L V K Y P V W V M N V V P V N S D K D T L G 1711 AGCAATTTACGAGCGAGGGTTCATCGGCACTTACCAGGACTGGTGTGAAGCCTTCTCGACGTATCCGAGGACCTACGACCTTTTGCACGC518 A I Y E R G F I G T Y Q D W C E A F S T Y P R T Y D L L H A 1801 CGACAATTTGTTCAGCATCTACCAGGACAGGTGCGACATAACGGACATCCTCCTGGAGATGGACAGGATACTGAGGCCCGAGGGCACGGC5

34、48 D N L F S I Y Q D R C D I T D I L L E M D R I L R P E G T A 1891 GATCATCCGCGACACGGTCGACGTGCTCACCAAGGTCCAGGCCATAGCCCAGCGGATGCGGTGGGACAGCCGCATCCTGGACCACGAGGA578 I I R D T V D V L T K V Q A I A Q R M R W D S R I L D H E D 1981 CGGGCCCTTCAACCAGGAGAAGGTCCTCGTGGCGGTCAAGACGTACTGGACGGCCGACCCATCGGAGCACAGC

35、TGAGCTGCAGCTCTCTG608 G P F N Q E K V L V A V K T Y W T A D P S E H S * 2071 AGCTCCGAAATGGCTTGTCCGGTAACTAGGTGTGACGCGATGATGGTGTCGGTTTTCGCCATCTCGGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT2161 GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAGTAAGCAGTGTGTGACCACGTGCGCAGTCGCTTGTTCCTCTCGCCTTTTTTGTCTAATTCTTTGTAGTT2251 CGGGTCGAAATGGAAACCAAAAAAATACGTCGAG

36、CAGATCATAGGTTCTTTTTAGCTTGTACGACCAGAGATTGTTACTATGTAGTACTA2341 AGATTGACTTACTGGAAAAATAGGCCTTTTACTGAAAAAAAAAAAAAAAAAA起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TGA)用下劃線標(biāo)注；DUF248保守區(qū)用下劃線標(biāo)注；SAM結(jié)合基序用著重點(diǎn)標(biāo)注The start codon (ATG) and the stop codon (TGA) were both underlined. The conserved region of DUF248 was underlined under the deduc

37、ed amino acid sequences; SAM-binding motif was emphasized with dots圖1 W89全長(zhǎng)cDNA和推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 1 The full-length cDNA sequence and predicted amino acid sequence of W89A.B A. W89蛋白的DUF248保守區(qū)與其它相關(guān)蛋白的氨基酸序列比對(duì)分析，圖中SAM結(jié)合基序用著重點(diǎn)標(biāo)注；B. W89全長(zhǎng)氨基酸序列與其它相關(guān)蛋白的同源性分析。BAD67956：水稻；AAP78933：擬南芥；BAD29526：水稻；CAD41579：水稻；CAB

38、80884：擬南芥A. Amino acid sequence alignment of DUF248 conserved region of W89 with other related proteins. SAM-binding motif was emphasized with dots. B. Homology tree of W89 with other related proteins. BAD67956: Oryza sativa; AAP78933: Arabidopsis thaliana; BAD29526: O.sativa; CAD41579: O. sativa; C

39、AB80884, A. thaliana圖2 W89與其它相關(guān)蛋白的同源性分析Fig. 2 Sequence alignment of W89 with other related proteinsB EV EIB: BamHI; EV: EcoRV; EI: EcoRI圖3 以(-32P-dCTP)標(biāo)記W89基因片段作為探針進(jìn)行的Southern雜交Fig. 3 Southern blot analysis of W89 hybridized with -32P-dCTP-labeled W89 3-end fragment as probe0 h 2 h 5 h 10 h 干旱Drough

40、tABA高鹽Salt低溫ColdActin圖4 W89在各種脅迫處理下的表達(dá)Fig. 4 Expression of W89 under treatments of ABA, drought, salt and cold旱，誘導(dǎo)了W89的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控其它基因的表達(dá)提高植物的抗逆性。4 結(jié)論本研究從小麥中克隆到一個(gè)受干旱、低溫和ABA誘導(dǎo)的新基因。分析表明W89以單拷貝存在于基因組中，它編碼的蛋白可能與其它蛋白或轉(zhuǎn)錄因子相互作用，參與早期干旱脅迫下的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此本研究克隆的W89基因可能在調(diào)控植物抗逆性中起重要作用。為了更清楚地了解W89在植物逆境中的作用，筆者將采用基因敲除的方法，研究W89

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