扶正抑瘤顆粒藥物血清誘導(dǎo)小鼠肝癌細胞凋亡及其機制的研究

1、扶正抑瘤顆粒藥物血清誘導(dǎo)小鼠肝癌細胞凋亡及其機制的【論文集】研究    【關(guān)鍵詞】  ,扶正抑瘤顆粒    摘要  目的：研究中藥復(fù)方扶正抑瘤顆粒藥物血清對小鼠肝癌H22細胞凋亡的影響及其作用機制。方法：采用扶正抑瘤顆粒藥物血清，溫育體外培養(yǎng)的H22小鼠肝癌細胞。流式細胞儀進行細胞周期分析，檢測凋亡率；透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)變化；鏈霉親和素生物素過氧化物酶復(fù)合物（streptavidinbiotin peroxidase complex, SABC）免疫細胞化學(xué)法觀察凋亡相關(guān)蛋白Bcl2和Bax的變化。

2、結(jié)果：扶正抑瘤顆粒藥物血清可影響細胞周期，使小鼠肝癌H22細胞的增殖阻滯在G1/G0期，并可測到凋亡峰，同時可下調(diào)Bcl2蛋白的表達，上調(diào)Bax蛋白的表達（扶正抑瘤顆粒藥物血清組與空白對照組比較，P<0.05）。結(jié)論：扶正抑瘤顆?？赏ㄟ^影響細胞生長周期，調(diào)節(jié)Bcl2和Bax蛋白的表達誘導(dǎo)小鼠肝癌細胞凋亡。關(guān)鍵詞  扶正抑瘤顆粒; 細胞凋亡; 細胞周期; 原癌基因蛋白質(zhì)cbcl2; BaxEffects of Fuzheng Yiliu Granulemedicated serum on apoptosis of liver cancer cells from mice and

3、its mechanismABSTRACT  Objective: To study the effects of Fuzheng Yiliu Granule (FZYLG)medicated serum on apoptosis of liver cancer cells H22 from mice and its mechanism. Methods: Liver cancer cells H22 from mice were incubated in culture media containing sera from rabbits medicated with differ

4、ent doses of FZYLG. Flow cytometry was used to examine the cell cycle and analyze the apoptotic rate of the H22 cells. The morphological changes of the H22 cells were observed by transmission electron microscope and the apoptosis related proteins Bcl2 and Bax were examined by streptavidinbiotin pero

5、xidase complex (SABC) method.Results: FZYLGmedicated serum could influence the cell cycle and stop the proliferation of H22 cells at the G1/G0 phase with apoptotic peak being detected. In culture media with FZYLGmedicated sera, the expression of Bcl2 decreased while that of Bax increased as compared

6、 with that in culture medium with nonmedicated serum (P<0.05). Conclusion: FZYLGmedicated serum can induce apoptosis of the liver cancer cells H22 by influencing the cell cycle, downregulating the expression of Bcl2 and upregulating the expression of Bax.KEY WORDS  Fuzheng Yiliu Granules; ap

7、optosis; cell cycle; protooncogene proteins cbcl2; Bax抑制腫瘤細胞生長和促進其凋亡是許多抗腫瘤藥物的作用機制之一。我們研制的扶正抑瘤顆粒具有扶正祛邪、化瘀解毒之功效。體內(nèi)實驗和臨床研究發(fā)現(xiàn)，該藥有較好的抗癌作用1,2，但對其抗癌機制尚缺乏深入研究。本文通過血清藥理學(xué)方法，進一步觀察該藥對小鼠肝癌H22細胞的抑制作用，并從分子、細胞學(xué)水平探討其抗癌機制。1  材料與方法1.1  實驗動物  純種新西蘭家兔20只，雄性，體質(zhì)量1.82.5 kg，中國蘭州生物制品研究所動物室提供，合格證號14004；清潔級昆明種小鼠

8、20只，體質(zhì)量1822 g，蘭州醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，合格證號14005。1.2  藥物  扶正抑瘤顆粒（Fuzheng Yiliu Granules, FZYLG）由紅芪、當(dāng)歸、墓頭回、莪術(shù)按 3131的比例組方，甘肅省藥材公司提供生藥，蘭州佛慈制藥廠按標(biāo)準(zhǔn)工藝制成濃縮顆粒，烘干后裝袋，9 g/袋（相當(dāng)于生藥30 g）。復(fù)方天仙膠囊（Tianxian Capsules），0.25 g/粒，吉林通化長白山藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號03010543。1.3  儀器與試劑  CO2培養(yǎng)箱，日本三洋電機株式會社產(chǎn)品；流式細胞儀，美國Becton Dickin

9、son公司產(chǎn)品；倒置相差顯微鏡和普通光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司產(chǎn)品；JEM 100CX透射電子顯微鏡，日本電子株式會社產(chǎn)品；RPMI 1640培養(yǎng)基，美國GIBCO公司產(chǎn)品；小牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品；碘化丙啶，TritonX 100，RNase A均為Sigma公司產(chǎn)品；鏈霉親和素生物素過氧化物酶復(fù)合物（streptavidinbiotin peroxidase complex, SABC）法免疫組化試劑盒及多克隆抗體，武漢博士德公司產(chǎn)品。1.4  細胞培養(yǎng)  小鼠肝癌H22細胞由蘭州醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室惠贈。常規(guī)接種于昆明種小鼠腹腔保種。實驗前，

10、取腹腔接種7 d的小鼠乳白色腹水，用PBS液漂洗1次后調(diào)整細胞濃度為（15）×105/ml，轉(zhuǎn)種于含10%小牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中（內(nèi)含青霉素、鏈霉素各100 U/ml），于37 ，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。1.5  藥物血清制備  純種新西蘭家兔20只，隨機分成5組：空白對照組、FZYLG大、中、小劑量組和天仙膠囊組。空白對照組予以灌服生理鹽水；FZYLG大、中、小劑量組分別按9、4.5、2.25 gk1  1.6  細胞周期及凋亡分析  取對數(shù)生長期細胞，用空白RPMI 1640培養(yǎng)基

11、調(diào)整細胞濃度至5×105/ml，加樣于24孔板，分別加入各組血清至終濃度為20%。常規(guī)培養(yǎng)72 h后收集各孔細胞于離心管中，用PBS液離心漂洗2次，震蕩混勻后，沿管壁緩慢加入75%的冷酒精固定，4 過夜。測試前用PBS液洗去乙醇，加入RNA酶、Trition100和碘化丙啶混合液，避光染色30 min，流式細胞儀檢測，采用Multicycle DNA content and cell cycle analysis軟件進行數(shù)據(jù)處理。1.7  細胞超微結(jié)構(gòu)觀察  收集對數(shù)生長期細胞，用RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整濃度為2×106/ml，接種于24孔培養(yǎng)板中，

12、分別加入不同組的藥物血清和空白對照組血清，使其終濃度為20%，常規(guī)培養(yǎng)72 h后收集細胞于離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄去上清，沿管壁緩慢加入3%的戊二醛，4 固定過夜，后經(jīng)1%鋨酸固定，環(huán)氧樹脂Epon812包埋，超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛雙染色，用JEM100CX透射電子顯微鏡觀察并攝片。1.8  細胞凋亡相關(guān)蛋白檢測  載玻片用10%的多聚賴氨酸作防脫處理。細胞培養(yǎng)72 后，各組分別收集細胞懸液，500 r/min離心5 min，棄去上清，500 l PBS液重懸細胞，使細胞濃度為1×105/ml，離心涂片機涂片，室溫干燥。純丙酮室溫固定

13、20 min。純甲醇50份30% H2O2  1份，室溫下浸泡30 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。一抗均用PBS液按1100的比例稀釋，其余步驟嚴格按試劑盒說明進行。蘇木素輕度復(fù)染，梯度脫水，常規(guī)封片。將PBS液代替一抗按上述步驟操作，作為陰性對照，用已知陽性切片作為陽性對照。1.9  統(tǒng)計學(xué)方法  所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 10.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用x±s表示，采用方差分析的組間比較法，等級資料采用秩和檢驗。2  結(jié)果2.1  細胞周期及凋亡分析  FZYLG藥物血清作用72 h后，與空白對照組比較，S期、G2

14、/M期細胞減少，G0/G1期細胞增多，細胞增殖指數(shù)降低，尤以中、大劑量組變化顯著(P0.01)。各用藥組G0/G1期前出現(xiàn)了亞二倍體峰，即凋亡峰（apoptotic peak, AP），隨著用藥劑量的增大，細胞凋亡率增加，F(xiàn)ZYLG小、中、大劑量組與空白對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.01)；與天仙膠囊組比較，F(xiàn)ZYLG小、中劑量組無統(tǒng)計學(xué)意義，而FZYLG大劑量組則有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。見表1。2.2  細胞凋亡的超微結(jié)構(gòu)觀察  不同血清作用72 h后，在透射電子顯微鏡下觀察。非藥物血清培養(yǎng)的細胞，胞膜、核膜完整，微絨毛豐富，細胞器正常；藥物血清培養(yǎng)的細胞，可見部分細

15、胞染色質(zhì)固縮并凝結(jié)成塊狀，聚集在核膜周邊，細胞漿濃縮，基質(zhì)消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)疏松，胞漿內(nèi)空泡形成，部分細胞核發(fā)生碎裂。見圖1、圖2。2.3  Bcl2、Bax蛋白表達的變化  Bcl2、Bax陽性表達細胞可見明顯的棕黃色細胞輪廓及黃染的胞漿。判斷標(biāo)準(zhǔn)參照生秀杰3法：陰性（）：標(biāo)本中無陽性細胞著色；陽性（）：標(biāo)本中陽性細胞數(shù)<50%；強陽性（）：標(biāo)本中陽性細胞數(shù)50%。結(jié)果顯示：H22細胞經(jīng)藥物血清作用后，F(xiàn)ZYLG各劑量組Bcl2陽性反應(yīng)物強度明顯降低，染色變淺，而Bax陽性細胞數(shù)則明顯增加，染色加深，說明Bcl2陽性表達率降低而Bax蛋白表達增加，與空白對照組比較，有統(tǒng)計

16、學(xué)意義（P<0.05）。見表2。表1  不同培養(yǎng)條件對H22細胞細胞周期及凋亡的影響（略）Tab 1  Effects of different culture media on cell cycle and apoptosis of H22 cells*P<0.05, *P<0.01, vs culture medium with Tianxian Capsulemedicated serum; P<0.01, vs culture medium with nonmedicated serum表2  不同培養(yǎng)條件對H22細胞Bcl2和Ba

17、x蛋白表達的影響（略）Tab 2  Effects of different culture media on expressions of Bcl2 and Bax in H22 cells圖1  電鏡下空白對照組細胞超微結(jié)構(gòu)（×4000）（略）Fig 1  Ultrastructure of cells cultured in medium with nonmedicated serum examined by an electron microscope （×4000）圖2  電鏡下FZYLG中劑量組細胞超微結(jié)構(gòu)（×4

18、000）（略）Fig 2  Ultrastructure of cells cultured in medium with mediumdose FZYLGmedicated serum examined by an electron microscope （×4000）3  討論越來越多的研究表明，腫瘤的發(fā)生不僅與細胞增殖異常有關(guān)，亦與細胞的凋亡異常密切相關(guān)。因此，細胞凋亡被視為評估療效的一項新指標(biāo)4。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)中藥具有誘導(dǎo)癌細胞凋亡的作用，但大多集中于單味中藥及中藥有效成分抗癌效應(yīng)的研究。中藥復(fù)方具有“天然組合化學(xué)庫”之稱，其作用機制可能是“多靶點

19、”的5，而細胞凋亡的發(fā)生又是多因素、多基因、多層次級聯(lián)作用的結(jié)果，因此復(fù)方中藥較單一成分藥物更有可能干預(yù)、影響細胞凋亡的調(diào)控。細胞凋亡受多種基因的調(diào)控，有眾多凋亡基因參與凋亡過程。Bcl2是一種新型的原癌基因，Bcl2蛋白對不同因素引起的細胞凋亡均有抑制作用，它在各種正常細胞的激發(fā)和發(fā)育過程中表達，而在成熟或走向凋亡的細胞中不表達或低表達。與Bcl2相關(guān)的蛋白Bax可拮抗Bcl2FZYLG中紅芪、當(dāng)歸益氣養(yǎng)血以扶正，墓頭回、莪術(shù)活血化瘀、利濕解毒以祛邪，起到扶正抑瘤的功效。紅芪為豆科植物多序巖黃芪（Hedysarum polybotrys Hand.Mazz.）的干燥根，效同黃芪，其有效成分黃

20、芪總苷可誘導(dǎo)人肝癌HepG2細胞與Bel7402細胞凋亡7。當(dāng)歸的有效成分當(dāng)歸多糖能增強正常及免疫抑制小鼠的非特異性免疫功能，抑制小鼠移植性腫瘤的生長，延長生存時間8。莪術(shù)有效成分欖香烯能明顯抑制白血病細胞K562的增殖，使Bcl2的表達下降，并誘導(dǎo)K562細胞凋亡9。墓頭回（Patrinia heterophylla Bunge.）之有效成分丁香烯、環(huán)烯醚萜苷具有抗艾氏腹水癌和全面提高小鼠機體免疫功能的作用10。這些研究結(jié)果均為探討該方抗腫瘤機制提供了一定的依據(jù)。血清藥理學(xué)方法在中藥研究中具有明顯的優(yōu)勢，所獲實驗結(jié)果與在體實驗有較好的一致性，不僅能反映中藥及其可能的代謝產(chǎn)物的藥理（效）作用，

21、還能反映可能由藥物誘導(dǎo)的機體內(nèi)源性成分所產(chǎn)生的作用，某種程度上也克服了中藥本身理化性質(zhì)不確定對實驗的干擾，盡管在某些方面還存在爭議，但卻大大提高了中藥復(fù)方研究的科學(xué)性和可信度。本實驗將血清藥理學(xué)方法與細胞凋亡研究方法有機結(jié)合起來，采用FZYLG藥物血清溫育體外培養(yǎng)的小鼠肝癌H22細胞，研究該方對體外培養(yǎng)小鼠肝癌H22細胞凋亡的影響及其作用機制。實驗結(jié)果表明：FZYLG藥物血清具有誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的小鼠肝癌H22細胞凋亡的作用，而影響細胞增殖周期及調(diào)節(jié)Bcl2和Bax蛋白的表達可能是其誘導(dǎo)細胞凋亡的機制之一。參考文獻1  戴恩來, 趙健雄, 朱玉真, 等. 扶正抑瘤湯對腫瘤細胞周期及端粒酶影響的實驗研究J. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2001, 21(10): 760762.2  趙健雄, 曲  勇, 陳學(xué)忠, 等. 扶正抑瘤顆粒對食管癌、胃癌組織細胞周期及核轉(zhuǎn)錄因子的影響J. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2003, 23(12): 908910.3  生秀杰, 宋和存, 何秀琴. 抗凋亡基因Bcl2在子宮