高通量組學技術簡介ppt課件

1、高通量組學技術簡介高通量組學技術簡介1目錄l代謝組學及其相關技術l蛋白質組學及其相關技術l糖組學及其相關技術l脂質組學及其相關技術2代謝組學l代謝物組學（metabolomics）是在后基因組學時代興起的一門跨領域學科，其主要目標是定量的研究生命體對外界刺激、病理生理變化、以及本身基因突變而產生的其體內代謝物水平的多元動態(tài)反應。l代謝物組學誕生于上個世紀末，由英國倫敦帝國大學Jeremy Nicholson教授創(chuàng)立，之后得到迅速發(fā)展并滲透到多項領域，比如疾病診斷、醫(yī)藥研制開發(fā)、營養(yǎng)食品科學、毒理學、環(huán)境學，植物學等與人類健康護理密切相關的領域。3常用技術手段l色譜- -質譜聯(lián)用技術 l色譜是分

2、離混合物的有效方法, ,但難以得到結構信息, ,主要靠與標樣對比來達到未知物結構的推定; ;質譜法提供了豐富的結構信息, ,用樣又是幾種譜學方法中用量最少的。因此色譜與質譜的結合, ,成為分離和鑒定復雜樣品的理想手段, ,這是單獨采用色譜、質譜所不及的, ,同時也不存在類似于NMRNMR技術靈敏度低、檢測動態(tài)范圍窄弱點, ,有較高的靈敏度和專屬性。4l色質聯(lián)用技術已在代謝組學領域得到廣泛應用, ,特別是液質聯(lián)用(LC-MS)(LC-MS)、氣質聯(lián)用(GC-MS)(GC-MS)以及毛細管電泳- -質譜聯(lián)用技術(CE-MS)(CE-MS)。LC-MSLC-MS的應用涉及毒理、植物代謝、遺傳學、真菌

3、的代謝等諸多領域的不同類小分子物質的定性與定量。GC-MSGC-MS要求足夠的蒸氣壓和被分析物的熱穩(wěn)定性好, ,特別對極性物質的分析前要進行樣品的衍生化處理。但其高效、高選擇性、高靈敏度、用量少和分析速度快的優(yōu)點是其得到廣泛應用的主要原因。5lGCGC與TOFTOF/MS/MS以及四極桿質譜的聯(lián)用在代謝組學的研究中發(fā)揮了自身的優(yōu)越性。CE-MSCE-MS也是代謝組學中強大的分析工具。SogaSoga等分析了細菌代謝物經三重CECE分離后的近千種小分子物質, ,有利于代謝物的系統(tǒng)性分析。此外, ,毛細管電色譜(capillary (capillary electrochromatography,

4、 CEC),electrochromatography, CEC),與質譜的聯(lián)用在蛋白、多肽、氨基酸和糖類的分析中得到應用。6l核磁共振技術 l核磁共振(nuclearmagneticresonance,(nuclearmagneticresonance,NMRNMR) )是一種基于具有自旋性質的原子核在核外磁場作用下, ,吸收射頻輻射而產生能級躍遷的譜學技術。其特點為: :不破壞樣品的結構和性質, ,無輻射損傷; ;可在一定的溫度和緩沖液范圍內選擇實驗條件, ,能夠在接近生理條件下進行實驗; ;可設計多種編輯手段, ,實驗方法靈活多樣?；谶@種特點, ,核磁共振技術對完整器官或組織細胞內許多

5、微量代謝組分進行檢測, ,得到相應的生物體代謝物信息。7l綜合分析這些信息所反映的生物學意義, ,可了解生物體代謝的規(guī)律。二維和多維的核磁共振技術也成為了代謝組學研究領域的重要技術。另外,NMR,NMR技術還可以和色譜技術聯(lián)用, ,充分發(fā)揮各自優(yōu)勢, ,達到更為理想的分析效果。相關的高性能聯(lián)用技術將會用于小分子代謝物的定性與定量。8代謝組學的優(yōu)勢與劣勢9蛋白質組學l蛋白質組定義為一種基因組所表達的全部蛋白質。因蛋白質組具有時空性和可調節(jié)性, ,蛋白質組的概念實際指在特定時刻、特定環(huán)境和實驗條件下基因組所表達的全部蛋白質。10l蛋白質組學的核心在于大規(guī)模地對蛋白質進行綜合分析, ,通過對某種物種

6、、個體、器官、組織或細胞的全部蛋白質性質( (包括表達水平、結構、分布、功能、豐度變化、翻譯后修飾、細胞內定位、蛋白質與蛋白質的相互作用、蛋白質與疾病的關聯(lián)性) )的研究, ,對蛋白功能做出精細和準確的闡述。蛋白質組學最有價值的優(yōu)勢是它可以觀察在特定的時間下一個完整的蛋白質組或蛋白亞型在某種生理或病理狀態(tài)中, ,發(fā)生的相應的變化。11l蛋白質組學的研究內容主要有兩方面: :l結構蛋白質組學和功能蛋白質組學。結構蛋白質組學主要是蛋白質表達模式的研究, ,包括蛋白質氨基酸序列分析及空間結構的解析。l蛋白質表達模式的研究是蛋白質組學研究的基礎內容, ,主要研究特定條件下某一細胞或組織的所有蛋白質的表

7、征問題。12l常規(guī)的方法是提取蛋白質, ,經分離形成一個蛋白質組的二維圖譜, ,通過計算機圖像分析得到各蛋白質的等電點、分子量、表達量等, ,再結合以質譜分析為主要手段的蛋白質鑒定, ,建立起細胞或組織或機體在所謂正常生理條件下的蛋白質圖譜和數據庫。13l高效液相層析(HPLC)(HPLC)l雖然HPLCHPLC在蛋白組分析中未能廣泛應用, ,但其作為分離蛋白質的第一步, ,仍具有很好的前景。雙向高效液相層析(2D-HPLC)(2D-HPLC)也是一種很好的蛋白質分離純化方法。其第一相根據分子大小分離蛋白質, ,第二相是反向層析。2D -HPLC2D -HPLC分離蛋白質的容量比2-DE2-D

8、E大, ,且速度快。而毛細管柱反相高效液相色譜(RP-HPLC)(RP-HPLC)也比2-DE2-DE快速、分辨率高1212。目前, ,又出現(xiàn)了將不同液相層析聯(lián)合使用技術, ,稱之為連續(xù)液相層析, ,其大大提高了液相層析的效率14l親和層析l親和層析是利用分子生物學之間具有的專一性而設計的層析技術。一些生物分子和其配基之間有特殊的親和力, ,如抗原與抗體、酶與底物、激素與受體等, ,他們在一定條件下能結合為復合物。如果能將復合物中的一方固定在固相載體上, ,就可以從溶液中專一性的提純另一方。親和層析特異性強、簡便且高效, ,對含量少又不穩(wěn)定的活性物質更為有效, ,并可得到高產率的純化產物。l但

9、是, ,由于并非所有的生物分子都具有特定的配基, ,只有那些具有配基的生物分子才能用親和層析分離, ,所以親和層析應用范圍受到一定的限制15l毛細管電泳l毛細管電泳(capillary electrophoresis, CE)(capillary electrophoresis, CE)技術是在高電場強度作用下, ,對毛細管內徑(510Lm)(510Lm)中的樣品按分子質量電荷、電泳遷移率等差異進行有效分離, ,包括毛細管區(qū)電泳(CZE,(CZE,依據不同蛋白質的電荷質量比差異進行分離) )、毛細管等電聚焦(CIEF,(CIEF,依據蛋白質等電點不同在毛細管內形成pHpH梯度實現(xiàn)分離) )和篩

10、板-SDS-SDS毛細管電泳( (依據SDS-SDS-蛋白質復合物在網狀骨架中遷移速率的不同而實現(xiàn)分離) )等技術, ,其優(yōu)點是可實現(xiàn)在線自動分析, ,可用于相對分子質量范圍不適于2-DE2-DE的樣品, ,其缺點是存在對復雜樣品分離不完全的現(xiàn)象16糖組學l糖組學（GlycomicsGlycomics）又稱糖體學，是生物學的一個學門，專門研究寡糖類（oligosaccharideoligosaccharide）構造與功能。用來表示生物個體內擁有的所有碳水化合物。l糖組學研究技術的關鍵在于糖蛋白的分離和富集。目前，糖蛋白和聚糖分離策略主要途徑；一是經典的凝集素親和色譜“糖捕獲”方法，另一種是二維

11、電泳結合特殊染色的分離技術。17l植物凝集素探針l植物凝集素是一類非免疫來源的，無酶活性的，能與聚糖特異性結合的蛋白質，它想探針一樣可以捕獲到混合物中的聚糖，為目標細胞、組織或集體的糖組學研究提供一手資料。在凝集素親和色譜中最常用的植物凝集素有刀豆素A A、半乳糖凝集素、花生凝集素、橙黃網胞盤菌凝集素等。不同的植物凝集素用于分離不同類型的糖蛋白和糖肽，如ConAConA和GaL6GaL6特異吸附高甘露糖型和復雜型N-N-聚糖；在O-O-聚糖中GaL6GaL6專門吸附含有LacNAcLacNAc的聚糖。顯然，在糖捕獲操作中植物凝集素的應用還是有一定的限制的。18l糖基捕獲的過程，利用植物凝集素親

12、和柱捕獲糖蛋白的過程：a a、植物凝集素親和柱1 1捕獲一組糖蛋白；b b、糖蛋白被蛋白酶徹底水解；c c、水解產物在經植物凝集素親和柱1 1捕獲到糖肽；e e、肽鏈和糖鏈分別經HPLC/MSHPLC/MS分離鑒定；f f、獲得肽序列和糖鏈分子質量；g g、分析蛋白質序列并查詢數據庫獲得相關遺傳信息；h h、分析聚糖的結構獲得糖基化信息。使用不同的植物凝集素柱進行第二和第三次循環(huán)，捕獲其他類型的糖肽，可以對某個細胞核集體進行較全面的糖組學研究。19lPASPAS法最初是作為寡糖的熒光標記發(fā)展的。后來PASPAS運用在糖蛋白的二維電泳中，后修飾染色和鑒別染色技術對糖蛋白與肺湯蛋白的差異染色，染色

13、蛋白質在膠內水解用質譜測定準確的相對分子質量。該方法靈敏度較高，檢測限可達到300pg300pg，而且MSMS檢測PAPA衍生糖蛋白的靈敏度遠高于非衍生糖蛋白。20lSteinbergSteinberg等使用高碘酸將糖蛋白的聚糖氧化成醛，然后熒光染料Pro-Emerald 300Pro-Emerald 300共價結合到糖醛上產生高熒光共軛化合物。通過2DE2DE分離蛋白質，2DE2DE凝膠用SYPRORubySYPRORuby染料染色，所有蛋白質被染色成紅色，而糖蛋白與Pro-Emerald 300Pro-Emerald 300的共軛化合物在530nm530nm呈綠色，將非糖蛋白和糖蛋白區(qū)別開

14、。切下2DE2DE凝膠上糖蛋白點，可以進行后續(xù)的鑒定。21脂質組學l脂質組學是對生物體、組織或細胞中的脂質以及與其相互作用的分子進行系統(tǒng)分析的一門新興學科脂質具有多種重要的生物功能，脂質代謝異?？梢l(fā)諸多人類疾病，包括糖尿病、肥胖癥、癌癥以及神經退行性疾病等。l目前，脂質組學研究已成為一個前景廣闊的熱門領域，并廣泛地應用到包括藥物研發(fā)、分子生理學、分子病理學、功能基因組學、營養(yǎng)學以及環(huán)境與健康等重要領域22lTLCTLC法是最早應用于脂質分析的色譜法。它將脂類用硅膠板上行法展層, , 展開后的板上噴脂質顯色劑。顯色劑有碘蒸氣、Dittmer-lesterDittmer-lester鉬藍、Dra

15、gendorffDragendorff試劑、VaskovskyVaskovsky試劑和茚三酮等。各種脂質在TLCTLC板上展開后, , 脂質的定量可采用薄層色譜掃描儀計算積分值, , 或將脂質的斑點刮下來, , 然后測定其含量(Peterson and Cummings, (Peterson and Cummings, 2006)2006)。TLCTLC法分為單向和雙向2 2種。23l單向TLCTLC能夠同時分析幾個樣品, , 但很難將組分完全分開; ; 雙向TLCTLC可將脂類各組分完全分開, , 但是它1 1次只能分析1 1個樣品。TLCTLC法具有直觀、快捷的優(yōu)點, , 能快速分離脂質,

16、 , 而且價格比較便宜。脂質經過TLCTLC初步分離后也可以用氣相色譜和高效液相色譜做進一步的分析。24l但是, TLC, TLC法需要的樣品量大, , 測定的靈敏度和分辨率都很低。而且, ,由于TLCTLC板上的斑點在切除過程中極易發(fā)生不飽和脂類氧化, , 因而破壞了部分脂類結構。另外, , 顯色反應也容易受到樣品雜質的干擾。25l軟電離技術出現(xiàn)于2020世紀8080年代末期。這種技術的特征是可以使生物分子在無碎片斷裂的情況下進行離子化。l其優(yōu)點一是可不需要衍生化而直接對高分子量和不揮發(fā)性的混合物進行檢測; ; 二是被分析物碎片最少, , 有利于對樣品混合物的解析。l通過軟電離質譜技術進行脂質組學分析在動物和微生物中應用較早, , 分析方法也較為成熟。但是, , 該方法在植物上應用則相對滯后, , 主要因為植物比動物含有更多的難以分析的甘油糖脂, , 如MGDGMGDG、DGDGDGDG、SQDGSQDG等。26l電噴霧電離質譜( (ESI-MSESI-MS) )法l電噴離子化法(ESI)(ESI)是目前脂質組學分析中應用最多的軟電離法。該方法