中藥顯微鑒定

1、顯微鑒定顯微鑒定方法方法內(nèi)容提要內(nèi)容提要顯微鑒定的簡(jiǎn)介顯微制片方法的分類顯微制片方法植物顯微鑒定的簡(jiǎn)介植物顯微鑒定的簡(jiǎn)介(Microscopical Identification)v植物顯微鑒定是植物鑒定的重要手段之一。它通過植物組織、細(xì)胞、細(xì)胞后含物等特征進(jìn)行微觀分析，達(dá)到鑒別真、偽、優(yōu)、劣的目的。v植物顯微鑒別不但適用于中藥材（飲片），也適用于中成藥制品。這一檢測(cè)方法先后被中國(guó)藥典、香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)、日本藥局方、印度草藥典、美國(guó)藥典等采用。中國(guó)藥典中國(guó)藥典附錄附錄 顯微鑒別法顯微鑒別法 顯微鑒別法系指用顯微鏡對(duì)藥材（飲片）顯微鑒別法系指用顯微鏡對(duì)藥材（飲片）切片、粉末、解離組織或表面制片及含

2、藥材切片、粉末、解離組織或表面制片及含藥材粉末的制劑中藥材的組織、細(xì)胞或內(nèi)含物等粉末的制劑中藥材的組織、細(xì)胞或內(nèi)含物等特征進(jìn)行鑒別的一種方法。鑒別時(shí)選擇具有特征進(jìn)行鑒別的一種方法。鑒別時(shí)選擇具有代表性的供試品，根據(jù)各種鑒別項(xiàng)的規(guī)定制代表性的供試品，根據(jù)各種鑒別項(xiàng)的規(guī)定制片。制劑根據(jù)不同劑型適當(dāng)處理后制片。片。制劑根據(jù)不同劑型適當(dāng)處理后制片。顯微鑒別方法分類顯微鑒別方法分類 1 根據(jù)不同劑型適當(dāng)處理后制片，分為：v藥材（飲片）顯微制片：橫切片或縱切片制片、粉末制片、表面制片、解離組織制片、花粉粒與孢子制片、磨片制片。v含飲片粉末的制劑顯微制片：按粉末制片法制片v細(xì)胞壁性質(zhì)鑒別：木質(zhì)化細(xì)胞壁、木栓

3、化或角質(zhì)化細(xì)胞壁、纖維素細(xì)胞壁。v細(xì)胞內(nèi)含物性質(zhì)鑒別：淀粉粒、菊糖、草酸鈣結(jié)晶 2 根據(jù)切片方法，分為：徒手切片、冷凍切片、半薄切片（0.5-2.0微米）、超薄切片（ 50-70nm)。永久制片永久制片（以石蠟切片為例）（以石蠟切片為例）石蠟切片石蠟切片石蠟制片法石蠟制片法 借助于石蠟的特性，以其作借助于石蠟的特性，以其作為填充劑和包埋劑，用石蠟切片機(jī)進(jìn)行切為填充劑和包埋劑，用石蠟切片機(jī)進(jìn)行切片的制作方法。片的制作方法。 石蠟制片是目前植物性中藥重要的、常用石蠟制片是目前植物性中藥重要的、常用的、效果較好的切片方法之一，但制片周的、效果較好的切片方法之一，但制片周期較長(zhǎng)是其缺點(diǎn)。期較長(zhǎng)是其缺點(diǎn)

4、。石蠟制片的步驟及操作基本過程如下：石蠟制片的步驟及操作基本過程如下：取材取材固定固定沖洗沖洗脫水脫水透明透明浸蠟及包埋浸蠟及包埋切片切片粘片粘片脫蠟脫蠟染色染色透明透明封片。封片。 1 1 材料的選擇材料的選擇選材（取樣）：選材（取樣）：根據(jù)鑒定要求，選擇有代表性的部位；根、根莖、藤根據(jù)鑒定要求，選擇有代表性的部位；根、根莖、藤莖等類圓形的材料要包含有中心部位，至少為莖等類圓形的材料要包含有中心部位，至少為1/41/4以上；以上；葉、花萼、花冠等材料要包含主脈部位。葉、花萼、花冠等材料要包含主脈部位。材料切成長(zhǎng)材料切成長(zhǎng)3cm3cm、直徑、直徑1cm1cm左右塊或段，待切面應(yīng)削平。左右塊或段

5、，待切面應(yīng)削平。樣品的量一般不得少于實(shí)驗(yàn)所需用的樣品的量一般不得少于實(shí)驗(yàn)所需用的3 3倍，即倍，即1/31/3供實(shí)供實(shí)驗(yàn)分析用，另驗(yàn)分析用，另1/31/3供復(fù)核用，其余供復(fù)核用，其余1/31/3則為留樣保存，則為留樣保存，保存期至少一年。保存期至少一年。2 2 材料的預(yù)處理材料的預(yù)處理處理：處理：清洗清洗 水洗，用柔軟的毛刷輕輕的刷洗表面。水洗，用柔軟的毛刷輕輕的刷洗表面。殺生殺生 固定固定 保存保存 將需要制片材料迅速殺死，使組織保持原生活狀將需要制片材料迅速殺死，使組織保持原生活狀態(tài)，一般以滲透力較強(qiáng)的的藥劑作殺生劑較好。態(tài)，一般以滲透力較強(qiáng)的的藥劑作殺生劑較好。 固定液固定液 FAA F

6、AA固定液固定液 38%38%甲醛：冰醋酸：甲醛：冰醋酸：70%70%乙醇乙醇 5 5：5:955:95 用于根、莖、葉、花藥、子房的固定，固定時(shí)間用于根、莖、葉、花藥、子房的固定，固定時(shí)間24h24h FPA FPA固定液固定液 38%38%甲醛：丙酸：甲醛：丙酸：70%70%乙醇乙醇 5 5：5:955:95 卡諾氏固定液卡諾氏固定液 乙醇：冰醋酸乙醇：冰醋酸 3:13:1 用于根尖、花藥、子房的固定，固定不超過時(shí)間用于根尖、花藥、子房的固定，固定不超過時(shí)間24h24h材料處理時(shí)，注意不能影響要觀察的顯微鑒別特征。如要觀察菊材料處理時(shí)，注意不能影響要觀察的顯微鑒別特征。如要觀察菊糖、粘液等

7、在軟化、切片、裝片等過程中，均不可與水接觸，以糖、粘液等在軟化、切片、裝片等過程中，均不可與水接觸，以免溶解消失；要觀察揮發(fā)油、樹脂等，則不可與高濃度乙醇或其免溶解消失；要觀察揮發(fā)油、樹脂等，則不可與高濃度乙醇或其它有機(jī)溶媒接觸。它有機(jī)溶媒接觸。 3 3 脫水脫水脫水常用乙醇、二氧六環(huán)、正丁醇、叔丁醇、丙酮等脫水常用乙醇、二氧六環(huán)、正丁醇、叔丁醇、丙酮等目的目的 除去組織中的水分，使細(xì)胞變硬；除去組織中的水分，使細(xì)胞變硬； 便于包埋物進(jìn)入組織及細(xì)胞，便于切片；便于包埋物進(jìn)入組織及細(xì)胞，便于切片； 脫水后的組織再經(jīng)過透明，便于觀察。脫水后的組織再經(jīng)過透明，便于觀察。方法方法 由由30%30%、

8、50% 50%、 70% 70%、 85% 85%、 95% 95%、 100% 100%、 100% 100%各級(jí)酒精各級(jí)酒精處理處理2-4h2-4h。4 4 透明透明透明常用二甲苯、氯仿、苯、甲苯等透明常用二甲苯、氯仿、苯、甲苯等目的目的 便于包埋劑便于包埋劑( (石蠟）及封藏劑（加拿大樹膠）的互相融合石蠟）及封藏劑（加拿大樹膠）的互相融合方法方法 用用1/41/4二甲苯、二甲苯、 1/3 1/3二甲苯、二甲苯、 1/2 1/2二甲苯、二甲苯、 二甲苯、二甲苯、 二甲二甲苯各處理苯各處理3-4h3-4h。4 4 透蠟、包透蠟、包埋埋透蠟常用固體石蠟透蠟常用固體石蠟?zāi)康哪康?石蠟進(jìn)入細(xì)胞組織

9、內(nèi)，便于切片石蠟進(jìn)入細(xì)胞組織內(nèi)，便于切片透蠟方法透蠟方法 50%50%、75% 75% 、100%100%石蠟各處理石蠟各處理3h3h。溫度：。溫度：63-64 63-64 包埋包埋 材料在石蠟中央，便于修蠟和切片材料在石蠟中央，便于修蠟和切片5 5 蠟塊的分割、切片蠟塊的分割、切片蠟塊的分割蠟塊的分割 將蠟塊修成適合的大小，蠟邊與材料盡量平行。上將蠟塊修成適合的大小，蠟邊與材料盡量平行。上寬下窄，分割好的材料要妥善保管。寬下窄，分割好的材料要妥善保管。切片切片 將蠟塊粘在切片機(jī)上，調(diào)整刀的角度（與蠟塊保持將蠟塊粘在切片機(jī)上，調(diào)整刀的角度（與蠟塊保持1515的的傾角），厚度調(diào)整為傾角），厚度調(diào)

10、整為2020微米以內(nèi)。微米以內(nèi)。注意：切片時(shí)速度要快，不可來回拉鋸式切割；注意：切片時(shí)速度要快，不可來回拉鋸式切割； 切片時(shí)右手不動(dòng)，只是右臂移動(dòng)，動(dòng)作用臂力而不用腕力。切片時(shí)右手不動(dòng)，只是右臂移動(dòng)，動(dòng)作用臂力而不用腕力。 機(jī)器切片機(jī)器切片石蠟切片機(jī)石蠟切片機(jī)滑走切片機(jī)滑走切片機(jī)選片選片 選擇薄而完整的切片置載玻片上，加水選擇薄而完整的切片置載玻片上，加水1 1滴于玻片上，在展片滴于玻片上，在展片臺(tái)上展片，置低倍鏡下觀察，選取組織構(gòu)造完整、顯微特征清晰者臺(tái)上展片，置低倍鏡下觀察，選取組織構(gòu)造完整、顯微特征清晰者備用。備用。 粘片粘片 用蛋清與甘油（用蛋清與甘油（1:11:1）。順時(shí)針）。順時(shí)針

11、用力攪拌均勻，攪拌至無泡沫產(chǎn)生為止。用力攪拌均勻，攪拌至無泡沫產(chǎn)生為止。粘片時(shí)，滴少許粘片劑，用手指涂抹均勻。粘片時(shí)，滴少許粘片劑，用手指涂抹均勻。6 6 選片、粘片選片、粘片染色方法染色方法 復(fù)染和單染復(fù)染和單染 ；滴染和泡染。；滴染和泡染。染料的分類染料的分類 天然和人工染料；堿性、中性和酸性染料；核燃料、細(xì)天然和人工染料；堿性、中性和酸性染料；核燃料、細(xì)胞質(zhì)染料、細(xì)胞壁染料、組織化學(xué)染料、活體染料等。胞質(zhì)染料、細(xì)胞壁染料、組織化學(xué)染料、活體染料等。常用染料常用染料 蘇木精、堿性品紅、番紅和固綠；蘇木精、堿性品紅、番紅和固綠； 封片封片 用加拿大樹膠封片、用加拿大樹膠封片、 目的目的 便于

12、長(zhǎng)期保存；由于便于長(zhǎng)期保存；由于加拿大樹膠折射率高適合在顯加拿大樹膠折射率高適合在顯微鏡下觀察。微鏡下觀察。 7 7 染色、透明及封片染色、透明及封片 透明透明 梯度二甲苯梯度二甲苯 目的目的 便于觀察便于觀察 冷凍切片冷凍切片v儀器：冷凍切片機(jī)儀器：冷凍切片機(jī)v包埋材料：水、膠水包埋材料：水、膠水v切片溫度：切片溫度：-20v優(yōu)點(diǎn)：節(jié)省時(shí)間、方便快捷。優(yōu)點(diǎn)：節(jié)省時(shí)間、方便快捷。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)：包埋時(shí)，不能有氣泡，否則會(huì)有空洞。包埋時(shí)，不能有氣泡，否則會(huì)有空洞。一定要將材料放直立膠水的中央，使材料完全被一定要將材料放直立膠水的中央，使材料完全被膠水包裹。并且外圍膠水的厚度要大于等于材料膠水包

13、裹。并且外圍膠水的厚度要大于等于材料的半徑，有利于粘片。的半徑，有利于粘片。不宜將材料和膠水凍的太硬，否則在切片過程中不宜將材料和膠水凍的太硬，否則在切片過程中會(huì)造成中間材料的破損。會(huì)造成中間材料的破損。切片時(shí)，切片卷起形成圓筒，是刀刃太鈍并附有切片時(shí)，切片卷起形成圓筒，是刀刃太鈍并附有雜物、刀得傾角太大、切片太厚等原因引起的。雜物、刀得傾角太大、切片太厚等原因引起的。切片有橫紋及薄厚不均一，是刀夾松緊不均一、切片有橫紋及薄厚不均一，是刀夾松緊不均一、刀的傾角過大引起的。刀的傾角過大引起的。切片有縱裂或縱條紋，是因?yàn)榈犊谟腥笨?，組織切片有縱裂或縱條紋，是因?yàn)榈犊谟腥笨?，組織太硬引起的。太硬引起

14、的。冷凍切片機(jī)冷凍切片機(jī) 粉末制片粉末制片1 1 藥材粉碎藥材粉碎 選取完整的藥材或待鑒定部位，粉碎，過選取完整的藥材或待鑒定部位，粉碎，過中國(guó)藥典中國(guó)藥典4 4號(hào)篩備用。號(hào)篩備用。 斯氏液裝片斯氏液裝片 斯氏液斯氏液由醋酸由醋酸甘油甘油水（水（111111）組成，主要用于觀）組成，主要用于觀察淀粉粒及一些遇水合氯醛試液易溶解的成分。如多糖類察淀粉粒及一些遇水合氯醛試液易溶解的成分。如多糖類成分、樹脂類成分等。成分、樹脂類成分等。 水合氯醛液裝片水合氯醛液裝片 水合氯醛試液能滲透組織，使皺縮的細(xì)胞膨脹；并能溶解水合氯醛試液能滲透組織，使皺縮的細(xì)胞膨脹；并能溶解淀粉粒、蛋白質(zhì)、樹脂、揮發(fā)油和葉綠

15、素等，使細(xì)胞組織淀粉粒、蛋白質(zhì)、樹脂、揮發(fā)油和葉綠素等，使細(xì)胞組織變得透明而清晰。變得透明而清晰。3.4 3.4 粉末特殊處理制片方法粉末特殊處理制片方法含多量淀粉的藥材粉末含多量淀粉的藥材粉末 大量淀粉粒的存在會(huì)大量淀粉粒的存在會(huì)影響觀察、描繪及攝影等效果。取一部分粉末于影響觀察、描繪及攝影等效果。取一部分粉末于試管中加水煮沸，使淀粉粒糊化而溶解，放置或試管中加水煮沸，使淀粉粒糊化而溶解，放置或用離心機(jī)使所需細(xì)胞、組織下沉管底，用長(zhǎng)吸管用離心機(jī)使所需細(xì)胞、組織下沉管底，用長(zhǎng)吸管將沉淀物吸出供制片觀察。將沉淀物吸出供制片觀察。3 3 粉末特殊處理制片方法粉末特殊處理制片方法含多量油類的藥材粉末

16、含多量油類的藥材粉末 進(jìn)行脫脂以除去大部進(jìn)行脫脂以除去大部分油脂，取少許粉末于小燒杯中，加氯仿少許攪分油脂，取少許粉末于小燒杯中，加氯仿少許攪拌浸漬，過濾，在濾紙上再加少許氯仿洗滌粉末拌浸漬，過濾，在濾紙上再加少許氯仿洗滌粉末即可。也可直接將粉末置載玻片進(jìn)行。即可。也可直接將粉末置載玻片進(jìn)行。含纖維較多的粉末含纖維較多的粉末 細(xì)胞彼此不分離，則可以用細(xì)胞彼此不分離，則可以用5%5%氫氧化鉀溶液浸漬若干小時(shí)或在水浴上加熱浸漬，氫氧化鉀溶液浸漬若干小時(shí)或在水浴上加熱浸漬，使組織分解后再行制片觀察。使組織分解后再行制片觀察。 顏色很深的藥材粉末顏色很深的藥材粉末 進(jìn)行脫色處理，取粉末少許進(jìn)行脫色處理

17、，取粉末少許置小燒杯中或載玻片上，加少許置小燒杯中或載玻片上，加少許3%3%的過氧化氫溶液的過氧化氫溶液（雙氧水）浸漬數(shù)分鐘，待粉末顏色變淺時(shí)，除去（雙氧水）浸漬數(shù)分鐘，待粉末顏色變淺時(shí)，除去多余液體，加新煮沸的冷蒸餾水，以除去粉末中的多余液體，加新煮沸的冷蒸餾水，以除去粉末中的大量氣泡即可，然后再行制片觀察。大量氣泡即可，然后再行制片觀察。水泛丸：全球面取樣，將丸藥從中心剖開，從水泛丸：全球面取樣，將丸藥從中心剖開，從1/21/2球球面上刮取。面上刮取。大蜜丸：將丸藥從中心剖開，從大蜜丸：將丸藥從中心剖開，從1/21/2或或1/41/4球面上刮球面上刮取；也可從內(nèi)部挑取適量粉末。取；也可從內(nèi)

18、部挑取適量粉末。4 4 中成藥粉末制片中成藥粉末制片散劑、顆粒劑、膠囊：挑取部分粉末；散劑、顆粒劑、膠囊：挑取部分粉末；包衣丸、片：剝除糖衣或包衣，取適量丸或片心磨碎包衣丸、片：剝除糖衣或包衣，取適量丸或片心磨碎后，取粉末裝片。后，取粉末裝片。 5 5 粉末半永久制片或永久制片粉末半永久制片或永久制片永久制片永久制片 制備粉末永久片需將粉末置離心管中，加制備粉末永久片需將粉末置離心管中，加50%50%70%70%的乙醇的乙醇使完全浸沒，用細(xì)玻棒攪拌使完全浸沒，用細(xì)玻棒攪拌5 51010分鐘后離心，傾去乙醇液；再加分鐘后離心，傾去乙醇液；再加95%95%乙醇攪拌離心，傾去乙醇液；再加無水乙醇乙醇攪拌離心，傾去乙醇液；再加無水乙醇2 2次，傾去乙醇液后加丙酮次，傾去乙醇液后加丙酮1 1次，然后用丙酮與二甲苯的等量混合液處理，每次次，然后用丙酮與二甲苯的等量混合液處理，每次1 12 2分鐘。最后加分鐘。最后加入二甲苯使材料透明，攪拌均勻后用滴管吸取少量混合液至載玻片上，入二甲苯使材料透明，攪拌均勻后用滴管吸取少量混合液至載玻片上，滴加滴加1 1滴中性樹膠液，蓋上蓋玻片即可。滴中性樹膠液，蓋上蓋玻片即可