南方醫(yī)科大學-氨基酸分析-2015級臨床醫(yī)學二-第7實驗室匯編

1、南方醫(yī)科女修生物化學實驗報告名:生物化學與分子生物學實驗教學中心實驗名稱氨基酸薄層層析實驗實驗日期2016年10月20日 實驗地點 第7實驗室合作者指導(dǎo)老師王涵多評分教師簽名批改日期一、實驗?zāi)康?、掌握薄層層析法的一般 步驟并了解相關(guān) 原理。2、掌握氨基酸薄層層析法的 基礎(chǔ)操作 。3、掌握通過計算遷移率（R值）來鑒定混合物的層析分離組分（此處為氨基酸混合液）。二、實驗原理1、薄層層析的原理薄層層析一般將固定相（固體吸附劑）涂布在固體上形成薄層進行層析的方法。當 液相（展開溶劑）在固定相上 流動時，由于，點在薄板上的混合氨基酸樣品隨 展開劑移 動的速率 因各氨基酸在展開溶劑中的 溶解度相異而不同

2、 ，而后者表現(xiàn)的差異取決于 吸附 劑對不同氨基酸的吸附力 ，繼而， 不同組分可兩兩分離 。此即以吸附 -解吸-再吸附-再 解吸機制反復(fù)進行分離樣品各組分。本實驗固定相支持物是硅膠，黏合劑是羧甲基纖維素鈉，展開劑則為冰醋酸、正丁 醇和水的混合物。通過測定 Rf 值來鑒定分離后的混合氨基酸的組分。2、氨基酸與茚三酮的顯色反應(yīng)茚三酮水化后生成的水合茚三酮， 該物質(zhì)與氨基酸可通過羧基反應(yīng)產(chǎn)生還原茚三酮 和氨基醛，還原茚三酮和氨基茚三酮共熱縮合生成 藍色化合物 ，氨基酸層析斑點即顯色。3、基于相對遷移率 Rf 值判定混合氨基酸組分層析中，物質(zhì)沿溶劑運動方向移動的距離與溶液前沿距起點的距離之比為Rf值，即

3、:R=原點至層析斑中心的距離/原點到層析斑對應(yīng)前沿的距離由于物質(zhì)在相同溶劑中具有確定的分配系數(shù)，故相應(yīng)的遷移率（Rf 值）亦為確定值， 因此可依據(jù) Rf 值鑒別層析分離的物質(zhì)。三、材料與方法：一）材料 0.01/molL丙氨酸； 0.01/molL精氨酸； 0.01/molL甘氨酸；混合氨基酸溶液試劑1 硅膠20.5%羧甲基纖維素鈉（ CMCN）a3展開溶劑 40.1%茚三酮溶液 5展層 - 顯色劑 儀器和器材 層析板（6cmx 15cm 小燒杯量筒（10ml）小尺子 毛細玻璃管 層析缸 烘箱 試驗流程 制板-點樣-層析-顯色三）具體步驟（請見下一頁）注意事項 1 吸附劑：薄層層析的吸附劑（包

4、括氧化鋁和硅膠等）的 顆粒大小通常以通過大概 200 目篩孔為佳 ，如若顆粒過大，展開時溶劑的推進速率快，則層析效果欠佳。反之，展開 過慢，斑點易拖尾，層析效果欠佳。2點樣：點樣次數(shù)依樣品溶液的濃度確定，樣品量過少時，一些組分難以顯現(xiàn)，樣品 量過多時易造成斑點過大，互相交叉或拖尾，則分離效果不好，點樣后的斑點直徑通常以0.2cm為宜。3.避免污染：層析全過程中，避免以手觸碰層析板，必要時戴上手套。四、結(jié)果與討論:（一）結(jié)果記錄：實驗圖譜如下:實驗數(shù)據(jù)及Rf值計算如下表:各斑點樣品至起點溶劑前沿至起點氨基酸名稱丙氨酸2.425.500.44甘氨酸1.815.500.33精氨酸1.195.500.

5、22混合點12.275.500.41丙氨酸混合點21.805.500.33甘氨酸混合點31.155.500.20精氨酸實驗現(xiàn)象:制版：獲得白色粘稠狀液體，將之 均勻涂抹在玻璃板上，在約1小時后凝固，烘干后為 白色石灰樣固體薄層平板。點樣：做好標記后，分別點樣，在點樣后點樣處因溶液浸潤而顏色變暗，干燥之后回復(fù) 原色。層析：層析液緩慢向上浸潤入層析板，推動在起點線的樣品緩慢上移（但該現(xiàn)象因無現(xiàn) 象而不被觀察到），一個小時后溶液前沿超過層析板的二分之一。顯色：如圖所示，可以看到前三列分別有遷移距離不等的三個氨基酸層析斑點顯現(xiàn)為紫 色，第四列顯現(xiàn)出類似紫色的三個色斑。（二）對結(jié)果的討論對實驗結(jié)果的討論

6、就混合氨基酸的層析狀態(tài)分析，如圖，層析斑點界限清晰，無拖尾和交叉現(xiàn)象，且 溶劑前沿規(guī)整（表明固定相涂布均勻），表明實驗效果較優(yōu)。直觀地看，由于特定氨基酸在相同平板層析的遷移率相同，故可簡單認為離 起點大致相等距離的顯色點代表同種氨基酸（A1; B2; C3）。故初步估測該混合氨基酸 液中包含：甘氨酸、丙氨酸和精氨酸三種氨基酸。其次，根據(jù) 遷移率的計算 （結(jié)果已在上表顯示），可見，混合液中分離出的三個顯色點 的遷移率分別與標準樣的遷移率分別對應(yīng) 大致相等 。綜上所述該混合氨基酸成分為甘氨酸、丙氨酸和精氨酸。操作對結(jié)果的影響的討論 實驗過程做的是否恰當直接關(guān)系到，實驗結(jié)果的好壞，為了得到較好結(jié)果，

7、我們在過程 中做出以下討論。調(diào)漿：稱取硅膠過程中，由于硅膠密度較小，調(diào)節(jié)好天平后，稱量 開頭宜每次添加 較大量硅膠粉末 ，在添加過程中，為防止因產(chǎn)生揚塵或撒出造成污染，我組的處理方法 是藥匙由傾斜至豎直 ，將樣品導(dǎo)入天平托盤，而不是側(cè)向?qū)胨幤?，此種辦法可減少上 述隱患。帶添加至天平輕微晃動，再次取樣時用 指頭輕輕觸擊藥匙柄 ，使微量藥物落入 托盤內(nèi)，則可防止取樣過量。固定相的均勻度直接影響到層析速率。故加液調(diào)漿時，應(yīng)注意適當 勻速向相同方向 攪拌，燒杯豎直放立，此種做法可防止過多氣泡產(chǎn)生（我組做調(diào)漿步驟兩次，前一次原 因確為因攪拌不當產(chǎn)生較多氣泡）其次倒入玻璃板時,為了使倒板均勻我們采用的辦法是,首先在平板中央沿 平板長軸一路傾倒完畢（如圖綠色線），然后經(jīng)過傾倒區(qū)沿垂直長軸方向來回劃動 固定相（如圖藍色線），最后將少量為涂抹區(qū)補齊，這樣能較好地抹勻固定相。如右圖所示）烘干溫度控制在70C, 1h,防止固定相干裂。點樣步驟中，點樣次數(shù)應(yīng)適當（ 1/5 管-兩次； 1 /2 管-