Apelin通過Akt_eNOS機制促進肺血管內皮細胞一氧化

1、復旦學報(醫(yī)學版Fudan Univ J Med Sci2009J an ,36(1 Apelin 通過Akt/e NOS 機制促進肺血管內皮細胞一氧化氮釋放吳德華1姜楨1繆長虹1陳瑞珍2(1復旦大學附屬中山醫(yī)院麻醉科, 2心內科上海200032【摘要】目的探討Apelin 對肺血管內皮細胞釋放一氧化氮(NO 的影響及其機制。方法血管內皮細胞(PMV ECs 。(1 以1×105個/孔密度接種至24孔板融合后, 。分為2組:Apelin 組, 加入Apelin 至終濃度為10-8mol/L ; 對照組, DM 4個復孔。繼續(xù)培養(yǎng), 并分別在0min 、2min 、5min 、15mi

2、n 、30min NO 濃度。( 5個/孔密度接種至6孔板,80%融合后, 無血清培養(yǎng)24h , 至終濃度為10-8mol/L 。Apelin +Akt 抑制劑(Akt Akt 抑制劑預處理30min 。對照組加入等量DM EM 35min 后立即提取總蛋白, 用于Western blot 檢測磷酸化Akt (蛋白表達。結果與0min 時間點比較, 培養(yǎng)液中NO 濃度分別在2min 、5min 、15(P <0. 01或P <0. 05 , 其中在5min 時間點達到高峰。與對照組比較,Apelin 組磷酸化Akt 和磷酸化eNOS 表達增加(P <0. 01 , 與Apel

3、in 組比較,Apelin +Akt inhibitor 組磷酸化eNOS 表達降低(P <0. 01 。結論Apelin 促進PMV ECs 釋放NO ,Akt/eNOS 磷酸化參與Apelin 促進NO 釋放機制?！娟P鍵詞】Apelin ; 內皮, 肺; 一氧化氮; 內皮源性一氧化氮合酶; Akt ; 磷酸化; Akt 抑制劑【中圖分類號】R 364. 1【文獻標志碼】ACorresponding aut hor E 2mail :jiangzhen66hotmail. comApelin promotes NO release involving the mechanismof A

4、kt/e NOS in pulmonary endothelial cellsWU De 2hua 1, J IAN G Zhen 1, MIAO Chang 2hong 1, C H EN Rui 2zhen 2(1Department of A nesthesiolog y ,2Department of Cardiology , Zhongshan Hos pital ,Fudan Universit y , S hanghai 200032, China 【Abstract 】Objective To investigate t he effect s of apelin on rel

5、ease of nitric oxide (NO and it smechanism in pulmonary microvascular endot helial cells (PMV ECs . Methods PMV ECs between passage 2and 3cult ured from neonatal rat of 24hours after birt h were starved serum 2free for 24hours , and t hen used to following st udies. Part :The effect s of apelin on r

6、elease of NO in PMV ECs at different time :1×105cells per well grown in 242well plates were divided randomly into 2groups :apelin group was added wit h 10-8mol/L apelin ; control goup wit h equal volume of serum 2free DMEM.Then t he concentrations of NO in cult ural medium were detected in both

7、 group s at five different time point s of 0min , 2min , 5min , 15min and 30min. Part :The effect s of apelin on phosphorylations of endothelial nitric 2oxide synt hase (eNOS and Akt :5×105cells per well grown in 62well plates were divided into 3groups :apelin group was added wit h 10-8mol/L of

8、 apelin ; apelin +Akt inhibitor groupwas pretreated wit h 5mol/L of Akt inhibitor 30min prior to incubated wit h apelin ; control group wit h equal volume of serum 2free DMEM. Five min later Western blot was used to assay protein expressions of phosphorylations of endot helial nitric 2oxide synt has

9、e and Akt. R esults Compared wit h t he control group , the concentration of NO in cultural medium increased at the three time point s of 2min , 5min ,and 15min (P <0. 01or P <0. 05 , wit h t he peak at t he point of 5min (P <0. 01 . Compared wit h the control group , apelin induced an incr

10、ease in protein expressions of phosphorylation of bot h Akt and eNOS significantly in apelin group (P <0. 01 . Compared wit h t he apelin group ,75 復旦學報(醫(yī)學版 2009年1月,36(1 protein expressions of phosphorylation of eNOS significantly decreased in Apelin +Akt inhibitor group (P <0. 01 . Conclusion

11、s Apelin can induce NO release. Apelin promoting phosphorylation of Akt/eNOS is possibly one of t he mechanisms to induce NO release.【K ey w ords 】Apelin ; endot helium , lung ; endot helial nitric oxide synt hase ; Akt ; phosphorylation ; Akt inhibitorApelin 是1998年發(fā)現的一種小分子活性肽,是血管緊張素受體21相關受體蛋白(A PJ

12、的內源性配體1。循環(huán)中的Apelin 主要通過肺血管內皮合成和釋放2, 具有重要的心血管調節(jié)功能:舒張血管、降低血壓3,4, 保護心肌受損、增強心肌收縮力5, 拮抗血管緊張素對心血管系統(tǒng)的不良作用6, 同時對血管內皮細胞7、心肌細胞具有保護作用8。其中Apelin Akt 成NO 9Apelin 對體外培養(yǎng)的肺血管內皮細胞NO 釋放作用以及Akt/eNOS 通路是否參與其中。材料和方法主要材料p G lu Apelin 213(PhoenixPharmaceuticals 公司, 美國 ,DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(G ibco 公司, 美國 , 胰蛋白酶(上海生工生物工程技術服務有限公司 ,

13、 兔抗人八因子抗原相關抗體(vWF 一抗(Centacrui 公司, 美國 , 熒光標記抗兔二抗(Jackson 公司, 美國 ,ABC 免疫化學試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司 , 硝酸還原酶法一氧化氮檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所 , 磷酸化Akt (Ser473 一抗、磷酸化eNOS (Ser1177 一抗(Cell Signaling 公司, 美國 , G APDH 一抗(上海晶美生物技術有限公司 , 抗兔二抗(上海晶美生物技術有限公司 ,Akt 抑制劑(1L 262Hydroxymethyl 2chiro 2inositol22(R 222O 2methyl 232O 2oct

14、adecylcarbonate , No. 170121, BioVision 公司, 美國 , 其他試劑均為分析純。肺微血管內皮細胞培養(yǎng)與鑒定10取24h 新生SD 大鼠(復旦大學醫(yī)學院動物房 ,75%酒精消毒, 眼科剪直接剪開胸腔, 取出肺組織, 放入盛有PBS 液(含肝素 的培養(yǎng)皿中, PBS 反復沖洗。沿肺組織外緣剪下1. 5mm ×1. 0mm ×1. 0mm 組織塊, 放入盛有無血清DM EM 培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中, 反復沖洗。置入直徑100mm 的培養(yǎng)皿(預先用含20%胎牛血清的DM EM 濕潤皿底 中, 放入37、5%CO 2的培養(yǎng)箱中, 組織塊貼壁2h 后加入

15、1. 5mL 含20%胎牛血清的DM EM 培養(yǎng)液。30h 時換液1次,60h 時去除組織塊, 加入含20%胎牛血清的DM EM 培養(yǎng)液8mL 繼續(xù)培養(yǎng), 每2天換液1次, 每次換半量培養(yǎng)液。57d 細胞長滿皿底后以0. 25%胰酶消化傳代?？箆WF (95%以上 ; 取2。PMVECs 釋放N O 的影響以1×105個/孔密度接種至24孔板,80%融合后, 無血清培養(yǎng)24h , 分為2組:Apelin 組, 加入Apelin 至終濃度為10-8mol/L ; 對照組, 加入等量無血清DM EM 培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng), 并分別在0min 、2min 、5min 、15min 、30min

16、 各時間點取培養(yǎng)液0. 2mL 入EP 管中, -70保存, 一周之內檢測NO 。每個時間點設立4個復孔, 每孔取培養(yǎng)液一次。NO 檢測按照NO 檢測試劑盒說明書操作。Apelin 對PMVECs 磷酸化Akt 及磷酸化e N OS影響以5×105個/孔密度接種至6孔板,80%融合后, 無血清培養(yǎng)24h , 分為3組:Apelin 組加入Apelin 至終濃度為10-8mol/L ; Apelin +Akt inhibitor 組加入Apein 前用5mol/L 濃度的Akt抑制劑預處理30min ; 對照組加入等量serum 2f ree DM EM 培液。每組設立3個復孔。繼續(xù)培

17、養(yǎng)5min后立即提取總蛋白, 用于Western blot 檢測。Western blot 檢測冰上操作, 用PBS 洗滌細胞2次, 加入含PMSF 的RIPA 裂解液150L/孔, 輕輕吹打混勻。裂解液轉移入EP 管中, 冰上放置20min ,12000×g 4離心30min 。取上清, 用BCA 法行蛋白定量。上樣緩沖液標化各組濃度, 100水浴5min 。取50g 蛋白上樣進行SDS 2聚丙烯酰胺凝膠電泳。半干法行蛋白轉膜。5%BSA 2PBST 封閉1h 。磷酸化Akt 、磷酸化eNOS 和GA PD H 一抗4孵育過夜(11000 , 二抗室溫孵育1h (15000 。經洗

18、滌、顯影、灰度掃描后, 以目的條帶磷酸化Akt 和磷酸化eNOS 和內參條帶GA PD H 的灰度比值分別表示磷酸化Akt 和磷酸化eNOS 表達水平。統(tǒng)計學處理采用SPSS 11. 5統(tǒng)計軟件處理,計量資料以均數±標準差(x ±s 表示,NO 檢測值兩組間相同時間點比較采用獨立樣本t 檢驗; 不同85 吳德華, 等. Apelin 通過Akt/eNOS 機制促進肺血管內皮細胞一氧化氮釋放 時間點NO 檢測值和Western blot 檢測值采用單因素方差分析, 組間比較采用L SD 檢驗, P <0. 05為差異有統(tǒng)計學意義。結果Apelin 在不同時間點對PMVE

19、Cs 釋放N O 的影響在PMV ECs 培養(yǎng)液中加入10-8mol/L 的Apelin 后, 與對照組比較, 培養(yǎng)液中NO 濃度分別在2min 、5min 、15min 各時間點都出現增加(P <0. 01或P <0. 05 ;NO 濃度總體趨勢為先增加后降低, 其中在5min 時間點達到高峰(與對照組比較, P <0. 01 ; 之后,NO 濃度逐漸降低。在30間點,NO (圖 圖1不同時間10-8mol/L Apelin 對PMVE Cs 釋放N O 影響Fig 1E ffect of apelin of 10-8mol/L at differenttime on N

20、O production in PMVECs(1 P <0. 01,(2P <0. 05vs control group ;(3P <0. 01, (4P <0. 05vs t he 0min time pointApelin 對PMVECs Akt/e N OS 磷酸化蛋白表達影響與對照組比較, Apelin 組PMVECs 磷酸化Akt 和磷酸化eNOS 表達明顯增加(P <0. 01 ; 與Apelin 組比較,Apelin +Akt inhibitor 組PMVECs 磷酸化eNOS 表達明顯降低(P <0. 01 (圖2、3 。討論新生大鼠肺組織A

21、pelin 、A PJ 表達明顯高于其他組織11, 因此本研究選用新生大鼠肺微血管內皮細胞作為研究對象。Apelin 可誘導一氧化氮合成, 并呈劑量依賴性降低大鼠的收縮壓、舒張壓和平均動脈壓3,4。一氧化氮合酶抑制劑可抑制Apelin 誘導的NO 增加, 同時抑制Apelin 誘導的降壓反應4。動物體內研究顯示靜脈注射Apelin 2min 左右體內NO 合成達高峰, 之后逐漸恢復正常3。然而先前有關Apelin 促進NO 合成增加的研究主要在動物體內完成, 而NO 又主要由內皮細胞合成和分泌,Apelin 直接對體外培養(yǎng)的肺血管內皮細胞分泌NO 的影響如何未見報道。本研究選用包含2min 在

22、內的6個時間點來檢測Apelin 對肺血管內皮細胞釋放NO 的影響。結果顯示,Apelin 可明顯刺激肺血管內皮細胞釋放NO , 并可持續(xù)15min 。其中在Apelin 加入培養(yǎng)液后5min 左右,NO 釋放達高峰;30min 后NO 的釋放與對照組比較雖然有所增加但無統(tǒng)計學差異。大鼠靜脈注射Apelin 后血漿NO 濃度升高持續(xù)5min , 其中2min 時間點達高峰3。在Apelin 對離體大鼠胸主動脈段釋放NO 的研究中顯示, 加入Apelin 后3h 仍可檢測到大鼠主動脈孵育液中NO 濃度的升高, 并呈濃度依賴性12。與本研究結果相似, 但Apelin 刺激NO 釋放檢測時間上存在差

23、異, 考慮與選用的研究對象不同有關。本研究進一步從細胞水平上證實了Apelin 促進NO 的生成。95 復旦學報(醫(yī)學版 2009年1月,36(1 NO 具有廣泛的生物學效應, 調節(jié)循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、神經系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等一系列生理活動13。其產生是以L 2精氨酸為底物由NO 合酶(NOS 催化的多步反應生成。NOS 有3型:型為nNOS , 它主要表達于中樞和外周神經元中, 在肺血管內皮細胞和肺組織中不表達nNOS 或表達量極低; 型為iNOS (可誘導型 , 主要存在于巨噬細胞、中性粒細胞、肝細胞等的胞質內, 與炎癥相關的多種因素可誘導其表達增高,iNOS 一旦表達增高, 可高速產生NO

24、, 參與機體病理生理過程; 型為內皮型NOS (eNOS , 它廣泛存在于內皮細胞, 在維持內皮形態(tài)和功能上起著極其重要作用。生理狀態(tài)下(如正常血流剪切力 的一些刺激可誘導內皮細胞酸化, 生成少量NO 持9。12是通過增加, iNOS 的活性。因此刺激內皮細胞釋放NO 有利于機體向“好”的方向發(fā)展。Apelin 具體是通過何種機制促進內皮細胞NO 釋放? 研究表明,Apelin 經過受體A PJ 介導可誘導小鼠肺微血管內皮細胞eNOS 磷酸化4。而PI3K/Akt 激活可導致eNOS 磷酸化, 釋放NO 9。Apelin是否也通過PI3K/Akt 的激活, 進一步激活eNOS磷酸化, 從而導致

25、NO 的釋放? Masri 等14在研究Apelin 促進中國倉鼠卵巢細胞(C HO 增殖實驗中得出Apelin 可刺激C HO Akt 磷酸化。Ishida 等4研究顯示Apelin 通過其受體A PJ 可誘導小鼠肺微血管內皮細胞eNOS 磷酸化, 而A PJ 基因敲除后Apelin 誘導的eNOS 磷酸化作用消失。本研究得出相似的結果,Apelin 可促進肺血管內皮細胞Akt 磷酸化和eNOS 磷酸化。使用Akt 抑制劑后, Apelin 誘導的eNOS 磷酸化受到明顯抑制。從而證實Apelin/A PJ Akt/eNOS NO 信號通路的存在。在細胞信號轉導中, PI3K/Akt 的磷酸

26、化參與細胞活動的多種調節(jié)15:參與介導細胞存活和抑制細胞凋亡機制; 促進細胞周期進展; 磷酸化和活化內皮細胞eNOS , 促進血管新生和NO 釋放等。因此Akt/eNOS 磷酸化通路是Apelin 促進內皮細胞NO 釋放的機制之一。綜上所述,Apelin 可促進肺血管內皮細胞釋放NO , Akt/eNOS 磷酸化參與Apelin 促進NO 釋放機制。參考文獻1Tatemoto K , Hosoya M , Habata Y , et al . Isolation andcharacterization of a novel endogenous peptide ligand for t he

27、human APJ receptor J .B iochem B iophys Res Commun , 1998,251(2 :471-476.2G oetze J P ,J ens FR , Jom C , et al . Apelin :a new plasmamarker of cardiopulmonary diseaseJ.Regulatory Pepti des , 2006,133(1-3 :134-138.3T atem oto K,T akayama K,Z ou MX , et al . The novel peptide apelinlowers blood press

28、ure via a nitric oxide 2dependent mechanismJ.Regulatory Pepti des ,2001,99(2-3 :87-92.4Ishida J , Hashimoto T , Hashimoto Y , et al . Regulatory rolesforAPJ ,aseven 2transmembranereceptorrelatedtoangiotensin 2type 1receptor in in vivo J .JB iol ,2004-279.5AS et . effect s of apelin onand elect rophy

29、siology J .B and B il p hysical ResearchCommunications ,2007,357(4 :889-895.6Zhong J C , Yu XY , Yu H , et al . Apelin modulates aorticvasculartoneviaendot helialnitricoxidesynt hasephosphorylation pat hway in diabetic miceJ.Cardiovascul arResearch ,2007,74(3 :388-395.7Christopher MC , Susan LD , Melanie KM , et al . Apelin , t heligand for t he endot helial G 2protein 2coupled receptor , APJ , is a potent angiogenic factor required for normal vascular development of t he frog embryoJ.Develop mental B iolog y , 2006,296(1 :177-189.8賈月霞, 曹軍, 齊永芬, 等. Apelin 對異丙基腎上腺素誘導的大鼠心肌缺血性損傷的影響J.中國病