酯酶產(chǎn)生菌株的分離篩選

1、技 術(shù) 與 方 法酯酶產(chǎn)生菌株的分離篩選覃擁靈1,2 何海燕1,2 李 楠 1 陳山嶺 1 梁智群13(廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 南寧 530004 1 (河池學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 宜州 摘要 :利用溴甲酚紫染色法和發(fā)酵測酶活的方法 , Z M1及 518S rDNA ( 。經(jīng)過紫外誘 變處理 , 得到 1株正突變株 Z M M1, 在適合條件下 , 10413%。 傳代實驗表明Z M M1具有良好的遺傳穩(wěn)定性 。關(guān)鍵詞 :灰綠犁頭霉 , , , , 中圖分類號 :025322654(2007 0320549204The Screening of Microorganism Producin

2、g EsteraseQI N Y ong 2Ling 1,2 HE Hai 2Y an 1,2 LI Nan 1 CHE N Shan 2Ling 1 LI ANG Z hi 2Qun 13(College o f Life Science and Technology , Guangxi Univer sity , Nanning 530004 1(Departerment o f Chemistry and Life Science , H echi Univer sity , Yizhou 546300 2Abstract :Astrain named Z M 1capable of p

3、roducing esterase had been isolated from soil sam ples by the methods of brom ocresol purple staining technique and the determ ination of esterase value. The strain was identified as Ab sidia glauca Hagem based on its m orphological characteristics and the sequence sim ilarity of ribosomal DNA 2ITS.

4、 A strain named ZZ M 1was selected after UV mutagenesis ,The results proved that Z M M 1had steady transm issibility ,when Z M M 1was cultivated at 32 for 48h with 160r m in , the yields of esterase was 58176U m L ,10413%higher than Z M 11K ey w ords :Ab sidia glauca Hagem ,Esterase , Screening , Id

5、entification , UV mutagenesis 3通訊作者 T el :077123270733, E 2mail :zqlianggxu. edu. cn收稿日期 :2006209218, 修回日期 :2006211214 酯酶 (Esterase , EC3111111 是重要的工業(yè)酶類 , 水解酯類產(chǎn)生相應(yīng)的酸和醇 , 在有機相中可以完成 酯化 、 轉(zhuǎn)酯 、 酯交換等反應(yīng) , 而且大多數(shù)反應(yīng)具有不 對稱選擇性 , 可以專一性制備用化學(xué)法難以合成的 手性化合物 , 如液晶 、 光學(xué)活性藥物及其前體 , 廣泛 應(yīng)用于食品工業(yè) 、 醫(yī)藥行業(yè) 、 日用化工業(yè) 、 軍事業(yè)和 生物防護等

6、領(lǐng)域14。微生物種類繁多 , 生長周期短 、 易于分離和誘 變 、 可工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng) , 利用微生物發(fā)酵是工業(yè) 化生產(chǎn)酯酶的良好途徑 。目前 , 國內(nèi)外對于酯酶在 生物轉(zhuǎn)化方面的研究報道較少 , 獲得高酶活的酯酶 產(chǎn)生菌有廣闊的應(yīng)用前景 。作者從含油土壤中篩選出產(chǎn)酯酶菌株 , 對其進行了形態(tài)特征 、 分子生物 學(xué)鑒定 , 并利用紫外誘變選育到一株遺傳性狀穩(wěn)定 的酯酶高產(chǎn)菌株 。1 材料與方法111 主要儀器和試劑BACK M AN J2221高速冷凍離心機 (美國 Backman公司 ;UV 21601紫外分光光度計 (日本 SHI M ADZ U 公司 ;320pH Meter (Mett

7、ler toledo 公司 ;DNA Marker (T aK aRa 公司 ;PCR 純化試劑盒 (T aK aRa 公司 ; ITS 引物 (大連寶生物工程公司合成 ; iCycler T M型 PCR 儀 (BI O 2RAD ; 水平電泳儀 (北京六一儀器公司 ;945 2007年 34(3 微 生 物 學(xué) 通 報G el DocT MXR 型凝膠成相系統(tǒng) (BI O 2RAD 。試劑均為國產(chǎn)分析純試劑 。 112 土樣分別采集煉油廠 、 牛奶廠 、 肉聯(lián)廠和食堂排污 口等富含油脂環(huán)境的土樣 。 113 培養(yǎng)基富集培養(yǎng)基 :(NH 4 2S O 42g ,NaCl 015g ,MgS

8、O 4 7H 2O 015g ,KH 2PO 42g , 乙酸乙酯 25m L , 瓊脂 20g , 定容 1L 。 初 篩 平 板 培 養(yǎng) 基 :酵 母 膏 10g , 溴 甲 酚 紫 0104g , 三醋酸甘油酯 30m L , 瓊脂 20g ,pH 值 710, 定容 1L 。復(fù) 篩 培 養(yǎng) 基 :蔗 糖 20g , (NH 4 2S O 45g , K 2HPO 41g ,MgS O 4 7H 2O 015g ,FeS O 4 7H 2O 0101g , 酵母膏 10g , 定容 1L 。 PDA 培養(yǎng)基按文獻 5配制 菌條件 :011MPa ,20min 。 114 菌種篩選1141

9、1 無菌生理鹽水 , 振蕩 5min , 。稀釋到一定倍數(shù) , 準確移取 011m L 稀釋懸液涂布于富集培養(yǎng)基平板 , 置于 32培養(yǎng) 3d 。 挑單菌落初篩平板劃線分離 , 直至分出純 菌株 , 并轉(zhuǎn)接到 PDA 斜面培養(yǎng)基 。11412 復(fù)篩 :無菌狀態(tài)下 , 將 10m L 無菌水移入 PDA斜面菌種制成孢子液 。準確量取 1m L 孢子液轉(zhuǎn)入 復(fù)篩 培 養(yǎng) 基 中 , 32 、 160r min , 培 養(yǎng) 48h , 發(fā) 酵 液 6000r min 離心 10min , 分別收集菌體和上清液 , 上清液 4 保存?zhèn)溆?;菌體 6000r min 離心 10min , 無菌生理鹽水洗

10、滌 兩次 , 收集菌體 。加入適量石英砂研磨破碎菌體 , 用 pH613P BS 緩沖液 4 下浸提菌體 24h ,6000r min 離心 10min , 收集菌體浸提液 4 保存?zhèn)溆?。測定發(fā)酵上清液和菌體浸提液的酶活 , 篩選出 酯酶高產(chǎn)菌株 , 確定菌株產(chǎn)酶部位 。 115 發(fā)酵液酶活測定參照禹邦超等多種形式酯酶總活力的混合底 物分光光度測定法進行測定6。酶活力單位定義 :每小時生成 l m ol 2NP (2萘酚 為 1個活力單位 (1U 。 116 菌種形態(tài)學(xué)觀察依據(jù)菌落形態(tài)特征 , 菌絲的生長情況以及孢子 的形狀大小等特征做出初步鑒定 。 117 總 DNA 的提取參照 Mich

11、aels on 等總 DNA 的提取方法進行7。 提取的總 DNA 用 70%(v v 乙醇洗滌沉淀 2次 , 晾干后溶于適量 TE (pH810 , -20 保存?zhèn)溆?。 118 PCR 擴增PCR 引物按 White 等報道設(shè)計8。 引物 ITS1的序列為 :5 2TCCG T AGG TG AACCTG CGG 23 , 引物 ITS4的序列為 :5 2TCCTCCG CTT ATTG AT ATG C 23 , 由大連 寶生物工程公司合成 。 PCR 擴增體系為 :2X G Cbu ffer 1215L ,2mm ol L dNTP 215L , 5m ol L ITS1引 物 015

12、L , 5m ol L ITS4引 物 01, 真 菌 總 DNA 2L ,LA T aq 013L , 加 25L 。反應(yīng)條 ; ,115min , ;721T aK aRa 瓊脂糖凝膠 DNA 純化試劑盒回收 PCR 產(chǎn)物 , 將 PCR 產(chǎn)物送上?；瞪锛夹g(shù)公司測序 , 利用 BLAST 軟件對測序結(jié)果與 G enBank +E M BL +DDB J +PDB 公布的已知的基因序列進行序列的同源性比對分析9,10。1110 紫外誘變處理紫外誘變條件及操作見文獻 11, 照射時間分 別為 0s 、 20s 、 40s 、 60s 、 80s 、 100s 、 120s ,140s 。以

13、未經(jīng) 紫外線照射處理的菌懸液涂布平板作為對照組計 算致死率 , 以 UV 的照射時間為橫坐標 , 致死率為縱 坐標 , 做致死率曲線 。誘變突變株篩選 :以致死率達 90%以上的照射 時間為誘變劑量處理菌懸液并涂布平板 , 避光培養(yǎng) 48h 后從篩選平板上選取黃色變色圈大的菌落取菌種一環(huán)接種至種子液培養(yǎng)基 , 32 ,160r min 培養(yǎng) 24h ; 按 10%接種量把 種 子 液 接 入 發(fā) 酵 液 , 32 , 160r min 培養(yǎng) 48h 后測酶活 。 1111 遺傳穩(wěn)定性實驗將篩選到的菌株接種于 PDA 培養(yǎng)基上傳代 , 每 代都在相同的發(fā)酵培養(yǎng)條件下培養(yǎng) , 共傳 8代 , 測定

14、 其酶活 。2 結(jié)果211 菌種初篩和復(fù)篩初篩平板培養(yǎng)基中的溴甲酚紫指示劑的變色 范圍為 PH 值 618512, 顏色由紫 黃 。酯酶把初 篩平板培養(yǎng)基中的三醋酸甘油酯水解得到乙酸 , 培養(yǎng)基 pH 值下降 , 以溴甲酚紫指示劑黃色變色圈直 055 微 生 物 學(xué) 通 報 2007年 34(3徑和菌落直徑之比作為酯酶產(chǎn)生菌的初篩依據(jù) 。 結(jié)果如圖 1和圖 2所示 。圖 1 Z M1在 PDA 培養(yǎng)基的菌落情況圖 2 Z M1在初篩培養(yǎng)基變色圈情況初篩培養(yǎng)基分離篩選出 12株產(chǎn)酯酶活力較高 的菌株 , 編號為 Z M1 Z M12。復(fù)篩實驗表明 , 黃色 變色圈直徑和菌落直徑之比值越大的菌種

15、, 發(fā)酵液 酶活越高 , 添加有溴甲酚紫的初篩平板培養(yǎng)基以黃 色變色圈直徑和菌落直徑之比作為初篩模型可以 快速準確的篩選出產(chǎn)酯酶菌株 。篩選到一株酯酶 酶活較高的菌株 Z M1,Z M1菌絲生長迅速 , 黃色變色 圈直徑和菌落直徑之比值較大 , 酶活為 28176U m L 。 初篩和復(fù)篩的實驗結(jié)果見表 1。以 Z M1菌株作為 出發(fā)菌株進行紫外誘變處理 , 選育高酶活的菌株 。搖瓶復(fù)篩實驗只測到發(fā)酵上清液有酶活 , 胞體 破碎浸泡液無酶活 , 判斷該菌所產(chǎn)酯酶為胞外酶 。 212 菌種鑒定2121 1 菌落形態(tài)特征 :根據(jù)菌落形態(tài)特征及光學(xué)顯微鏡下觀察孢子和子實體的形態(tài) , 菌落在 PDA

16、培養(yǎng) 基平板上呈淺藍綠色 , 菌絲生長迅速 , 頂端膨大 ; 孢 子囊與中軸基合成卵形 , 囊軸為圓錐型 ; 孢子表面 光滑 , 較多 , 小圓形 , 成堆時為綠色 。21212 菌株 ITS 位點的序列測定及其同源性比較 :以 Z M1的基因組 DNA 為模板 , 通過 PCR 擴增其 ITS 位點 。 擴增產(chǎn)物用 112%的瓊脂糖凝膠電泳 , E B 染色后 , 紫外燈下切下約 600bp 的 PCR 擴增產(chǎn)物 , 試 劑盒回收 。 PCR 產(chǎn)物進行序列測定12。表 1 菌種初篩和復(fù)篩結(jié)果菌株變色圈直徑 菌體直徑(cm 酶活(U m L 菌絲生長情況Z M13186 1162=213828

17、176+Z M23152 1170=210726124+Z M33148 1172=210226112+Z M43132 1165=21011+Z M52192 1158=1185+2175 111+Z 72 114821145+2=118121103+2154 1145=117520111+Z M102147 1142=117419122+Z M112137 1139=117118187+Z M122128 1137=116617165+序列測定表明 ,Z M 1菌株 ITS 位點長 591bp 。利用 BLAST 軟件與 G enBank +E M BL +DDB J +PDB 中 已知的

18、基因序列進行序列的同源性比對分析 , 結(jié)果表明 , Z M 1與 報 道 的 犁 頭 霉 菌 (Absidia glauca (G enBank 號為 A J287135 具有極高的同源性 ,ITS 位點有 97%以上的同源性 。 依據(jù)菌株 ITS 位點的序列 分析結(jié)果 , 結(jié)合菌落形態(tài)觀察 , 菌落在馬鈴薯和酯 酶選擇初篩培養(yǎng)基平板上呈淺藍綠色 , 推測 Z M1菌株為灰綠犁頭霉 (Absidia glauca Hagem 13。 213 紫外誘變致死率曲線隨著紫外照射時間的延長 , 平板上的菌落數(shù)逐 漸減少 , 即致死率逐漸增大 , 當(dāng)時間達到 100s 時無 菌落生長 , 其致死率為 1

19、00%; 時間為 80s 時 , 致死率 為 9618%。紫外誘變的致死率曲線如圖 3所示 。 本實驗取 80s 的照射時間進行紫外誘變 。圖 3 紫外誘變致死曲線155 2007年 34(3 微 生 物 學(xué) 通 報214 紫外誘變結(jié)果實驗結(jié)果表明 , 以酶活為 28176U m L 的 Z M1為 出發(fā)菌株 , 經(jīng)紫外誘變得到 10株正突變菌株 , 編號 為 Z M M12Z M M10, 黃色變色圈直徑擴大 , 黃色變色圈 直徑和菌落直徑之比值也有所增加 , 菌絲生長速度 更快 , 酶活提高 , 其中 Z M M1酶活提高到 58176U m L , 提高了 10413%。 結(jié)果見表 2。

20、 說明紫外誘變后 Z M M1產(chǎn)酶酶活有明顯提高 , 以 Z M M1菌株作為實 驗菌株 , 進行遺傳穩(wěn)定性實驗 。表 2 紫外誘變實驗結(jié)果菌株 變色圈直徑 菌體直徑(cm 酶活(U m L 菌絲生長情況Z M M15168 1194=219258176+ Z M M25118 1196=216451+ Z M M35106 1194=2+ Z M M45193=248196+ Z M M51=215947136+ Z M M641 1193=215545189+ Z M M74187 1191=215442112+ Z M M84182 1190=215334156+ Z M M94181

21、1192=215133157+ Z M M104178 1191=215032176+215 紫外誘變遺傳穩(wěn)定性實驗Z M M1菌株的酶活為 58176U m L ,8次傳代后酶 活為 57147U m L , 為母代菌株酶活的 9718%, 代間酶 活差異不大 , 證明 Z M M1經(jīng)紫外誘變后遺傳性狀穩(wěn) 定 , 結(jié)果見表 3。表 3 紫外誘變正突變菌株遺傳穩(wěn)定性實驗結(jié)果 傳代 傳代 1傳代 2傳代 3傳代 4傳代 5傳代 6傳代 7傳代 8酶活(%從含油土壤中取樣 , 以酯類為唯一碳源 , 添加 指示劑溴甲酚紫作為篩選平板 , 以篩選平板上指示 劑的黃色變色圈直徑和菌落直徑之比作為初篩依

22、據(jù) ; 以多種形式酯酶總活力的混合底物分光光度測 定法進行發(fā)酵液酶活測定復(fù)篩 , 該方法可以對發(fā)酵 液酶活進行準確的微量分析 , 建立了一套酯酶產(chǎn)生 菌快速準確的篩選模型 。分離篩選得到產(chǎn)酯酶的菌株 Z M1, 經(jīng)形態(tài)特 征 、 分子生物學(xué)鑒定為灰綠犁頭霉 (Absidia glauca Hagem 。經(jīng) 過 紫 外 誘 變 , 得 到 一 株 酶 活 達 到 58176U m L 的酯酶高產(chǎn)菌株 Z M , ,、 酯酶的分離提取純化方法參考文獻1辛嘉英 , 李樹本 , 徐 毅 , 等 . 工業(yè)微生物 ,2000, 30:31341 2徐詩偉 , 徐 清 , 曹桂芳 , 等 . 微生物學(xué)報 ,1995, 35:2752791 3湯一新 , 孫志浩 , 華 蕾 , 等 . 工業(yè)微生物 ,2001, 3:1514Bridges J W ,M ackness M I ,Chiphman J k , et al . Comp Biochem , Physisiol , 1986, 43:1254126115諸葛健 , 玉正祥編 . 工業(yè)微生物實驗技術(shù)手冊 . 北京 :中國輕工 業(yè)出版社 ,1994, 6:36716禹邦超 , 鄧輝勝 ,