大腸埃希菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素的耐藥譜及其產(chǎn)ESBLs的研究

1、大腸埃希菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素的耐藥譜及其產(chǎn)ESBLs的研究         09-08-27 11:05:00     編輯：studa20             作者：陳云波 王震 查長(zhǎng)森 鄒立林 季敬章 彭穎 呂建新【摘要】  目的 了解臨床分離的54株大腸埃希菌對(duì)氨基糖類(lèi)苷類(lèi)抗生素的耐藥譜及產(chǎn)ESBLs情況，分析氨基糖苷類(lèi)修飾酶A

2、AC(3)-II的檢出率及該酶的一些特征。方法 采用MIC法測(cè)定臨床分離的54株大腸埃希菌對(duì)7種氨基糖苷類(lèi)抗生素的耐藥譜，用NCCLS推薦的酶抑制劑增強(qiáng)紙片擴(kuò)散法檢測(cè)產(chǎn)ESBLs菌株，并通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)、克隆測(cè)序和測(cè)定重組菌耐藥譜對(duì)aac(3)-II基因進(jìn)行研究。結(jié)果 54株大腸埃希菌對(duì)阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、鏈霉素、大觀霉素和奈替米星的耐藥率分別為14.8%、77.8%、59.3%、66.7%、68.5%、61.1%、22.2%；共檢測(cè)出產(chǎn)ESBLs菌株34株，占63.0%；aac(3)-II基因在54株大腸埃希菌中檢出率為88.5%；質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌產(chǎn)ESBLs且同時(shí)檢出aac(

3、3)-II基因。重組菌BL21(DE3)/pET26：aac(3)-II對(duì)慶大霉素和卡那霉素有耐藥性，對(duì)其余5種氨基糖苷類(lèi)抗生素沒(méi)有表現(xiàn)出耐藥性。結(jié)論 大腸埃希菌對(duì)慶大霉素的耐藥率最高，對(duì)阿米卡星的耐藥率最低；耐氨基糖苷類(lèi)抗生素的大腸埃希菌與其產(chǎn)ESBLs有相關(guān)性；重組菌BL21(DE3)/pET26：aac(3)-II僅對(duì)慶大霉素和卡那霉素產(chǎn)生耐藥。 【關(guān)鍵詞】  大腸埃希菌； 氨基糖苷類(lèi)抗生素； 修飾酶； 超廣譜內(nèi)酰胺酶； 耐藥性    Research on aminoglycoside resistance profiles and produc

4、ing ESBLs    ABSTRACT  Objective  To investigate the aminoglycoside resistance profiles and producing ESBLs of clinical Escherichia coli strains and analyze the characteristic of AAC(3)-II.  Methods  MIC tests of 7 aminoglycosides and ESBLs confirmation tests were

5、performed 54 strains of E.coli aac(3)-II gene was amplified by PCR and cloned into pET26b, then and sequenced. Activity of AAC(3)-II was tested by MIC method. Results  The resistant rates of 54 strains of E.coli to amikacin, gentamicin, kanamycin, tobramycin, streptomycin, spectinomycin, netilm

6、icin were 14.8%, 77.8%, 59.3%, 66.7%, 68.5%, 61.1%, 22.2% and 63.0% (34/54) of strains were found producing ESBLs. The positive rate of aac(3)-II gene was 88.5% (45/54). The aac(3)-II gene resistance to gentamicin and kanamycin, but not other 5 aminoglycosides.  Conclusions Fifty-four strains o

7、f E.coli had the highest resistant rate to gentamicin while had the lowest resistant rate to amikacin. ESBLs-producing strains were mostly in aminoglycoside -resistance E.coli. The aac(3)-II gene only mediates resistance to gentamicin and kanamycin.    KEY WORDS  Escherichia coli

8、;  Aminoglycosides;  Modifying enzymes;  Extended-spectrum beta-lactamases;  Antibiotic resistance     大腸埃希菌(E.coli)是條件致病菌，2002年全國(guó)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)網(wǎng)對(duì)所屬57家三級(jí)甲等醫(yī)院的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其臨床分離率列第一位(14.2%)1。目前國(guó)內(nèi)對(duì)大腸埃希菌的多重耐藥性已引起很大的重視，對(duì)-內(nèi)酰胺類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)抗生素(aminoglycosides)的耐藥機(jī)制有較多的研究，但兩者相關(guān)性的研究還不多。以54

9、株從臨床分離的大腸埃希菌為研究對(duì)象，測(cè)定菌株對(duì)7種氨基糖苷類(lèi)抗生素的最低抑菌濃度(MIC)及檢測(cè)其產(chǎn)超廣譜-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)，為臨床合理有效地應(yīng)用抗生素提供依據(jù)；同時(shí)克隆aac(3)-II基因到pET26b，檢測(cè)重組菌BL21(DE3)/pET26：aac(3)-II對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素的耐藥譜，為進(jìn)一步研究aac(3)-II基因奠定基礎(chǔ)。    1  材料和方法    1.1  實(shí)驗(yàn)菌株及質(zhì)粒    收集從2005年28月溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院臨床送檢的血液、腹水、尿液等無(wú)菌體液

10、標(biāo)本分離得到的大腸埃希菌，紙片法測(cè)定其對(duì)慶大霉素(gentamicin，抑菌圈直徑12mm)、卡那霉素(kanamycin，抑菌圈直徑13mm)和妥布霉素(tobramycin，抑菌圈直徑12mm)任一或以上耐藥菌共54株，其中已剔除重復(fù)菌株，細(xì)菌標(biāo)記為WYD加四位流水號(hào)(如WYD1094、WYD1102)。細(xì)菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)參照全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程進(jìn)行，并經(jīng)法國(guó)Bio-Merieux公司VITEK 60細(xì)菌鑒定儀鑒定。質(zhì)控的標(biāo)準(zhǔn)菌株為大腸埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603，宿主菌為BL21(DE3)，pET26b為表達(dá)載體，以上菌株及質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

11、60;   1.2  體外最低抑菌濃度的測(cè)定    采用瓊脂稀釋法測(cè)定阿米卡星(amikacin A)、慶大霉素、妥布霉素、卡那霉素(kanamycin)、奈替米星(netilmicin)、大觀霉素(spectinomycin)、鏈霉素(streptomycin)對(duì)54株大腸埃希菌的MIC，以大腸埃希菌ATCC25922為質(zhì)控菌株，按CLSI/NCCLS(2004)版解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果2。    1.3  超廣譜-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的檢測(cè)    ESBLs的檢測(cè)采用N

12、CCLS推薦的酶抑制劑增強(qiáng)紙片擴(kuò)散法。頭孢噻肟(CTX)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢噻肟/克拉維酸(CD3)、頭孢他啶/克拉維酸(CD2)紙片為英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品。單藥紙片(CTX、CAZ)與相應(yīng)的含酶抑制劑紙片(CD3、CD2)中任何一對(duì)的抑菌環(huán)直徑之差5mm為產(chǎn)ESBLs菌株。以大腸埃希菌ATCC25922為陰性對(duì)照株，肺炎克雷伯菌ATCC700603為陽(yáng)性對(duì)照株。    1.4  質(zhì)粒的提取及轉(zhuǎn)化    用質(zhì)粒提取試劑盒提取臨床分離菌株WYD1094、WYD1102的質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，涂布于含慶大霉素(8g/ml)的LB固體培養(yǎng)基中，挑取生長(zhǎng)的單個(gè)菌落，并分別記作為BL21/WYD1094，BL21/WYD1102。提取轉(zhuǎn)化菌的質(zhì)粒，1.0%瓊脂糖凝膠電泳。按“1.2”及“1.3”方法，對(duì)上述兩株轉(zhuǎn)化菌對(duì)7種氨基糖苷類(lèi)抗生素的MIC及產(chǎn)ESBLs的檢測(cè)。    1.5  氨基糖苷類(lèi)修飾酶基因aac(3)-II的檢測(cè)    1.6  aac(3)-II基因的克隆及重組菌的耐藥譜    選取一份PCR陽(yáng)性產(chǎn)物經(jīng)純化回收，NdeI和XhoI雙酶切后與經(jīng)相同雙酶切后