地塞米松對(duì)多發(fā)性硬化細(xì)胞因子的影響

1、    地塞米松對(duì)多發(fā)性硬化細(xì)胞因子的影響        摘要目的：多發(fā)性硬化(MS)是一種由Th1細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，因而減少T細(xì)胞產(chǎn)生-干擾素(IFN-)或增加白細(xì)胞介素-10(IL-10)的產(chǎn)生將會(huì)達(dá)到治療MS 的目的。通過(guò)計(jì)數(shù)分泌細(xì)胞因子IFN-和IL-10，檢測(cè)多發(fā)性硬化(MS)患者外周血單個(gè)核 細(xì)胞在地塞米松(Dex)影響下的IFN-和IL-10的分泌細(xì)胞水平。方法：將外周血單個(gè)核細(xì)胞暴露于中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘素抗原髓鞘堿 性蛋白進(jìn)行體外短時(shí)間培養(yǎng)，然后用Dex

2、作對(duì)比試驗(yàn)，用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT)檢測(cè) IL-10和IFN-分泌細(xì)胞，同時(shí)檢測(cè)其它神經(jīng)病組(OND)及健康對(duì)照組。結(jié)果：顯示MS患者IFN-分泌細(xì)胞水平高于對(duì)照組，Dex使MS患者 IFN-分泌細(xì)胞減少，對(duì)IL-10分泌細(xì)胞無(wú)明顯影響。結(jié)論：MS患者存在Th1/Th2細(xì)胞因子的失衡，Dex能抑制MS Th1類 細(xì)胞因子IFN-，恢復(fù)其兩類細(xì)胞因子之間的平衡而對(duì)MS患者產(chǎn)生治療作用。關(guān)鍵詞多發(fā)性硬化地塞米松-干擾素白細(xì)胞介素-10 Effect of Dexamethone in vitro on immune functions in mult iple sclerosisZhu

3、 Shijin, Zhou Wenbin, Tang Xinnian, et alDepartment of Neurology, The first Hospital of Changde City, Hunan. 415003AbstractObjective：Multiple sclerosis (MS) is postulated to be a Th1- type cell-mediated autoimmune disease. Thus therapies that dectease Tcell interf eron (IFN)- production or increase

4、interleukin (IL)-10 production would be e xpected to have an ameliorating effect on MS. High doses of glucocorticoids (GCs ) are widely employed to treat acute attacks in MS patients. Their beneficial eff e cts are partially due to their capacity ot regulate the cytokine network. In th e present wor

5、k, we have examined the effect of GCs on the production of the immu nosuppressor cytokine IL-10 and the inflammatory cytokine IFN-. Methods: Blood samples from MS patients suffering an acute rel apse were obtained, Levels of IL-10 and IFN- secreting cells in PBMC were dete rmined by ILISPOT, The exp

6、ressions of IL-10 and IFN- were studied in blood MNC of the MS patients after being cultured in the presence of myelin basic protein (MBP), without antigen; in the presence of Dexamethsone, without drug.Results: In vitro experiments employing normal PBMC showed tha t Dexamethsone downregulated both

7、MBP induced-IFN- and spontaneous expression of IFN- no effect on IL-10 secreting cells was found. Conclusion: In summary, our results demonstrate a Th1-type cyt okine bias in peripheral blood mononuclear cells of untreated MS patients that i s reversed by Dex treatment. These findings provide a basi

8、s for immune monitorin g of patients with MS and suggest tha treaments downregulate IFN- may prove to be beneficial in progressive MS.Key words Multiple sclerosis Dexamethsone Interferon- Interleukin-10多發(fā)性硬化(MS)是一種由CD4+細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)白質(zhì)的自身免疫性 疾病，以CNS的炎性脫髓鞘和小血管旁單個(gè)核炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為特征1，2。近年 來(lái)，對(duì)其發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展較快，很多作者

9、認(rèn)為CD4+細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子在其發(fā)病中起 重要作用。CD4+細(xì)胞可產(chǎn)生兩種細(xì)胞因子：即炎性細(xì)胞因子(Th1 cytoking, ck)，其可 以-干擾素(IFN-)為代表； 和調(diào)節(jié)因子(Th2)，其可以白細(xì)胞介素-10(IL-10)為代表。在正常情況下，Th1/Th2細(xì)胞因子互相拮抗處于相對(duì)平衡，機(jī)體處于免疫穩(wěn)定狀態(tài)。病 理情況時(shí)，二者平衡被打破，Th1細(xì)胞因子水平上升，Th2細(xì)胞因子水平下降，則導(dǎo)致細(xì) 胞 免疫介導(dǎo)的炎性疾病發(fā)生。通過(guò)免疫調(diào)節(jié)劑增強(qiáng)Th2 CK 的抑制作用或抑制炎性CK，來(lái)恢 復(fù)Th1和Th2之間的平衡似乎是一種可能的治療途徑3?？傻乃深愃幬锸欠浅Ｓ行У拿庖咭种苿?，廣泛的用

10、于治療各種自身免疫性炎性疾病 4。地塞米松(Dex)用于治療MS在急性期和預(yù)防復(fù)發(fā)方面都有明顯的效果，但作用機(jī) 制尚不十分清楚。為了解Dex對(duì)IFN-和IL-10的影響，我們應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISP OT)的技術(shù)，從單個(gè)核細(xì)胞(MNC)水平，在自發(fā)和暴露于髓鞘抗原髓鞘堿性蛋白(MBP)刺激下，分別加用Dex和不用Dex進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)了MS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞IFN-和IL-10分泌細(xì)胞。資料和方法臨床資料MS患者組：21例均為湘雅醫(yī)院1997年9月至1999年2月門診及住院患者，其中男性8例，女性13例。臨床診斷為MS5，年齡為1860歲，平均年齡39歲；病程為0.520年，平均10年

11、；9例患者無(wú)或僅留輕度功能缺損，其余有中度或嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損。所有受試者在采取標(biāo)本前6個(gè)月內(nèi)均未使用包括激素在內(nèi)的免疫抑制劑。其它神經(jīng)病組(OND)：18例，其中男性8例，女性10例，年齡3870歲，平均年齡55歲。腦梗死2例，病毒性腦膜炎2例，肌緊張性頭痛6例，多發(fā)性神經(jīng)病3例，單發(fā)性神經(jīng)病2例，面肌痙攣2例，三叉神經(jīng)痛1例。健康對(duì)照組(HC)：12名身體健康的醫(yī)院工作人員。標(biāo)本處理：外周血(PB)，10ml加等量Iscovel培養(yǎng)液混勻后，經(jīng)用淋巴細(xì)胞分層進(jìn)行密度梯度離心分離MNC，再用Dulbeco培養(yǎng)液洗滌離心3次，用加有抗生素的FCS的Iscovel培養(yǎng)液懸，調(diào)整MNC至109/L

12、?？乖苽洌篗BP自牛腦髓鞘素中提取，經(jīng)用十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SPS-PAGE)純化，顯示相對(duì)分子質(zhì)量為24萬(wàn)的單一條帶6。IFN-分泌細(xì)胞檢測(cè)：采用ELISPOT技術(shù)從單個(gè)核細(xì)胞水平檢測(cè)IFN-分泌細(xì)胞。所有試劑盒為MABTECHAB公司生產(chǎn)(Sweden)，使用濃度度為15mg/L小鼠抗人IFN-單克隆抗體100l包被于96孔硝酸纖維膜微量板(Millititre,Bedford,MA.USA)4過(guò)夜，用碳酸緩沖生理鹽水(PBS)，經(jīng)0.45m直徑濾膜濾過(guò)(下同)，洗板6次，每孔加入200l含有2×1055MNC，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Man-WhiteU檢驗(yàn)。IL-10分

13、泌細(xì)胞檢測(cè)，方法同上。結(jié)果1.Dex對(duì)自發(fā)性IFN-分泌細(xì)胞的影響，在MS組外周血中，自發(fā)性IFN-分泌細(xì)胞明顯增多。Dex影響后IFN-分泌細(xì)胞明顯減少，兩者相比有顯著性差異；OND和HC組上述條件下相比差異無(wú)顯著意義(表1)。表1地塞米松對(duì)MS、OND及HC組外周血單個(gè)核細(xì)胞的IFN-分泌細(xì)胞數(shù)的影響(x±s分泌細(xì)胞數(shù)/105MNC)例數(shù)MBP0Ag0DrugDex0DrugDexMS2123.5±15.77.4±3.812.3±9.73.3±1.2OND183.2±2.73.7±2.82.1±1.92.3&#

14、177;2.7HC121.3±1.11.5±1.71.0±0.92.1±1.3P<0.001<0.010Ag無(wú)任何抗原條件下，0Drug無(wú)任何藥物條件下，Dex地塞米松，P值為Dex組與0Drug組比較，下表同。2.Dex對(duì)抗原刺激下的IFN-分泌細(xì)胞的影響，在MS組PBL中，IFN-分泌細(xì)胞在MBP刺激下明顯增加，在Dex影響后，同樣刺激下IFN-分泌細(xì)胞增加明顯減少，兩者相比有高度顯著差異，OND和HC組未發(fā)現(xiàn)明顯差異(表1)。3.Dex對(duì)IL-10分泌細(xì)胞的影響，在所有MS、OND和HC組的PBL中發(fā)現(xiàn)有分IL-10泌細(xì)胞，在MS組無(wú)抗

15、原刺激下，Dex均能使IL-10分泌細(xì)胞增加，但與未加Dex條件下相比差異無(wú)顯著性意義(表2)。表2地塞米松對(duì)MS、OND及HC組外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-10細(xì)胞數(shù)的影響(x±s，分泌細(xì)胞數(shù)/105MNC)例數(shù)MBP0Ag0DrugDex0DrugDexMS214.2±6.845±3.519±3.822.2±4.6OND1828±3.527±5.724±3.321±6.9HC1227±1.922±2.423±2.125±6.5討論MS患者病灶內(nèi)發(fā)現(xiàn)有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)

16、，炎性細(xì)胞自循環(huán)進(jìn)入病灶內(nèi)的過(guò)程受到細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。對(duì)MS患者隨訪發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)或惡化多在感染后發(fā)生，感染后的IFN-水平增高可能是誘發(fā)MS的主要因素之一7。IFN-屬于Th1類細(xì)胞因子，參與免疫應(yīng)答及炎性反應(yīng)的誘導(dǎo)階段，主要來(lái)源于活化的單核巨噬細(xì)胞。其可促進(jìn)人類組織主要相容性抗原-(MHC-)在MS患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和周圍血中單核巨噬細(xì)胞的表達(dá)、加強(qiáng)抗原的呈遞、促進(jìn)T細(xì)胞的活化、和上調(diào)粘附分子在血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)，總之，在啟動(dòng)MS發(fā)作中起到中心的作用。有作者觀察到，在MS的急性期，IFN-的產(chǎn)生明顯增加，肌注重組IFN-可加重MS的病情8。本研究結(jié)果也顯示，MS患者IFN-分泌細(xì)胞高于0N

17、D組和正常對(duì)照組，表明循環(huán)中活化巨噬細(xì)胞與MS復(fù)發(fā)或急性發(fā)作有關(guān)。提示對(duì)抗IFN-的作用可能改善MS的病情5。本組對(duì)MS患者的IFN-分泌細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比檢查發(fā)現(xiàn)，MS患者的IFN-分泌細(xì)胞受Dex的影響，Dex對(duì)MS的IFN-分泌細(xì)胞有抑制作用，特別是對(duì)抗原刺激下IFN-分泌細(xì)胞增多時(shí)有明顯的抑制作用，所以臨床上Dex治療MS的急性期和復(fù)發(fā)時(shí)療效明顯，推測(cè)Dex可能是通過(guò)減少周圍血IFN-的合成，抑制IFN-誘導(dǎo)的HLADR的表達(dá)，拮抗IFN-的免疫激活作用而達(dá)到對(duì)MS的保護(hù)作用。糖皮質(zhì)激素可通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)免疫功能。在MS，其能抑制T細(xì)胞的增殖及功能而產(chǎn)生抗炎的活性作用。固醇類藥物可抑制促炎性

18、細(xì)胞因子IL-2、IFN-、TNF-和IL-1。另外，地塞米松可上調(diào)TGF-基因的表達(dá)，其為一種抗炎性細(xì)胞因子，可能在MS的緩解過(guò)程中起作用9。MS急性階段的早期，血腦屏障(BBB)被破壞，活化淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)入CNS形成脫髓鞘病灶，此種現(xiàn)象可被對(duì)比-增強(qiáng)的磁共振(MRI)所觀察到。而MRI發(fā)現(xiàn)，在MS的急性發(fā)作期使用固醇類藥物可迅速減輕BBB的破壞。BBB的修復(fù)可能是通過(guò)下調(diào)粘附分子表達(dá)，從而減少淋巴細(xì)胞進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)。固醇類藥物尚可增強(qiáng)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，因其能減少基質(zhì)金屬蛋白(MMP)及蛋白解酶的活性，后者能使血管基膜解體導(dǎo)致BBB破壞而使MS病灶形成10。糖皮質(zhì)激素的免疫抑制作用還包括誘

19、導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡、減少花生四烯酸產(chǎn)物的釋放，進(jìn)一步調(diào)節(jié)MS的炎性反應(yīng)11。目前公認(rèn)糖皮質(zhì)激素可減少單核巨噬細(xì)胞的分化并抑制其功能。這種抑制功能可能是首先封閉了IFN-mRNA的表達(dá)和IFN-的分泌而實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)激素與胞質(zhì)內(nèi)特異性受體結(jié)合后，這些活化的激素-受體復(fù)合物被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)。在細(xì)胞核內(nèi)，IFN-的合成在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平均受到抑制。激素-受體復(fù)合物可通過(guò)誘導(dǎo)IkBa抑制蛋白的合成而干擾轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的活性，從而自動(dòng)控制選擇性的誘導(dǎo)IFN-mRNA的變性12。文獻(xiàn)報(bào)道表明，其他Th1細(xì)胞因子如IFN-、IL-2、TNF-和IL-1等也可顯著地受到固醇類藥物抑制。對(duì)這些細(xì)胞因子合成的抑制也可

20、能發(fā)生在核轉(zhuǎn)錄水平，因?yàn)樘瞧べ|(zhì)激素能抑制NF-kB和AP-1的活性，淋巴因子基因誘導(dǎo)需要轉(zhuǎn)錄因子參與。另外，TNF-的活化過(guò)程依賴于金屬蛋白酶的活化，如上所述，糖皮質(zhì)激素中抑制金屬蛋白酶的活性13。TNF-和IFN-一樣，在MS的炎性病灶形成中起著關(guān)鍵性的作用。很久以來(lái)人們即觀察到，治療劑量的糖皮質(zhì)激素使用可以使血中的中性粒細(xì)胞數(shù)量明顯增加。這是因?yàn)樘瞧べ|(zhì)激素受體產(chǎn)生了調(diào)節(jié)和抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞表面粘附分子的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)的作用，從而減少內(nèi)皮對(duì)靜止單個(gè)核淋巴細(xì)胞的粘附性，故循環(huán)中淋巴細(xì)胞增加。在MS，血管內(nèi)皮的改變可增加BBB的通透性，容許淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)入CNS，在炎性病灶形成中起關(guān)鍵性作用。有作者報(bào)

21、道，在圍繞MS炎性病灶周圍的血管上有粘附分子的表達(dá)，且通過(guò)MRI研究表明，患者粘附分子水平的高低與病灶的演變有關(guān)14。本研究顯示IFN-分泌細(xì)胞在MS患者中明顯增高，而其已被證明為粘附分子的強(qiáng)烈誘導(dǎo)劑。因此，糖皮質(zhì)激素作用于MS的另一個(gè)重要機(jī)制為調(diào)節(jié)內(nèi)皮對(duì)炎性刺激的反應(yīng)。這也可解釋當(dāng)糖皮質(zhì)激素治療MS時(shí)，增強(qiáng)-對(duì)比的MRI可觀察到破壞了的BBB迅速得到修復(fù)。然而，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)入CNS的被封閉不僅是因?yàn)檎掣椒肿拥南抡{(diào)，也可能是由于糖皮質(zhì)激素干擾了基質(zhì)金屬蛋白酶的合成。IL-10主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，可抑制抗原提呈細(xì)胞的功能及T細(xì)胞增殖，抑制Th1細(xì)胞分泌CK，可下調(diào)IL-1、IL-2、IFN-

22、、TNF-等炎性CK的產(chǎn)生和單核/巨噬細(xì)胞MHC類復(fù)合物的表達(dá)，單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的作用亦被強(qiáng)烈抑制15，故IL-10為重要的免疫調(diào)節(jié)因子。有報(bào)道表明，IL-10與MS病情的緩解或復(fù)發(fā)有密切的關(guān)系，在其急性期，IL-10水平處于低值，而緩解期水平則上升16。Gayo等17報(bào)道，可的松類藥物能促進(jìn)Th1類CK向Th2類CK轉(zhuǎn)化的傾向，可上調(diào)Th2類CK如IL-10、IL-4合成，與此同時(shí)抑制Th1類CK如IFN-的分泌。本組結(jié)果顯示Dex可使IL-10分泌細(xì)胞輕度增加，但與對(duì)照相比無(wú)明顯差異，說(shuō)明Dex對(duì)IL-10分泌細(xì)胞無(wú)明影響。由此推測(cè)，Dex通過(guò)抑制IFN-而使Th1和Th2細(xì)胞之

23、間的平衡得到恢復(fù)，從而抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)髓鞘再生，BBB修復(fù)達(dá)到治療目的。作者單位：朱世津（湖南省常德市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科415003）湯新年（湖南省常德市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科415003）周文斌（湖南醫(yī)科大學(xué)附屬湘雅醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科）楊歡（湖南醫(yī)科大學(xué)附屬湘雅醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科）肖波（湖南醫(yī)科大學(xué)附屬湘雅醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科）謝光潔（湖南醫(yī)科大學(xué)附屬湘雅醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科）參考文獻(xiàn)1Ffrench-Constant D.Pathogenesis of multiple s clerosis. Lancet.1994;343271275.2Lublin FD, Reingold SC. Defining the c

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