第四組琥珀酸脫氫酶競(jìng)爭(zhēng)性抑制

1、琥珀酸脫氫酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理器材與試劑實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康? 學(xué)習(xí)動(dòng)物的處死與組織勻漿的方法。 學(xué)習(xí)離心機(jī)的使用方法。 理解酶的競(jìng)爭(zhēng)抑制原理。2022-1-14背景介紹背景介紹琥珀酸脫氫酶是位于動(dòng)物細(xì)胞線粒體內(nèi)膜上的一種氧化酶，它直接與電子傳遞鏈相連，是呼吸鏈的標(biāo)志酶，亦即線粒體或細(xì)胞內(nèi)三羧酸循環(huán)的一種標(biāo)志酶。在體內(nèi)，該酶可使琥珀酸脫下的氫進(jìn)入FADH2呼吸鏈，通過(guò)一系列傳遞體最后傳遞給氧而生成水。當(dāng)在缺氧的條件下可用甲烯藍(lán)(藍(lán)色)作為受氫體時(shí),甲烯藍(lán)被氫還原成甲烯白(無(wú)色),其反應(yīng)如下：甲烯藍(lán)，又名亞甲藍(lán)，美藍(lán)甲烯藍(lán)，又名亞甲藍(lán)，美藍(lán)實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理:競(jìng)爭(zhēng)性抑制是指分子結(jié)構(gòu)與

2、底物相似的抑制劑可與底物競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合酶的活性中心，抑制酶的活力。競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的抑制程度取決于抑制劑與酶的親和力及與底物的相對(duì)比例。 草酸與琥珀酸的分子結(jié)構(gòu)相似，是琥珀酸脫氫酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。琥珀酸脫氫酶催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸。在體內(nèi)，琥珀酸脫下的2H 經(jīng)電子傳遞鏈傳遞，最后與氧結(jié)合生成水，并釋放出能量。在體外則可用甲烯藍(lán)（藍(lán)色）作為受氫體，甲烯藍(lán)接受琥珀酸脫下的2H 而被還原為甲烯白（無(wú)色）。在甲烯蘭含量一定的條件下，藍(lán)色消退的快慢程度可指示琥珀酸脫氫酶的活力，因此，可依據(jù)藍(lán)色消退時(shí)間來(lái)判斷該酶活力被抑制的程度。競(jìng)爭(zhēng)性抑制的機(jī)理競(jìng)爭(zhēng)性抑制的機(jī)理 競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑往往是酶的底物類似物或反應(yīng)產(chǎn)物；

3、抑制劑與酶的結(jié)合部位（活性中心）與底物與酶的結(jié)合部位相同； 抑制劑濃度越大，則抑制作用越大；但增加底物濃度可使抑制程度減??； 動(dòng)力學(xué)參數(shù)：Km值增大，Vm值不變。抑制程度取決于抑制劑與酶的親和力及與底物的相對(duì)比例注意：結(jié)合在酶的同一部位以及結(jié)構(gòu)類似并不是競(jìng)爭(zhēng)性抑制的必要條件，抑制劑結(jié)合的部位阻礙底物和酶的結(jié)合，即產(chǎn)生空間位阻也可以造成競(jìng)爭(zhēng)性抑制。 離心技術(shù)離心技術(shù):離心技術(shù)是利用物體高速旋轉(zhuǎn)時(shí)產(chǎn)生強(qiáng)大的離心力，使置于旋轉(zhuǎn)體中的懸浮顆粒發(fā)生沉降或漂浮，從而使某些顆粒達(dá)到濃縮或與其他顆粒分離之目的。這里的懸浮顆粒往往是指制成懸浮狀態(tài)的細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒和生物大分子等。離心機(jī)轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)時(shí)，當(dāng)懸浮顆

4、粒密度大于周圍介質(zhì)密度時(shí)，顆粒離開(kāi)軸心方向移動(dòng)，發(fā)生沉降；如果顆粒密度低于周圍介質(zhì)的密度時(shí)，則顆粒朝向軸心方向移動(dòng)而發(fā)生漂浮。離心力和相對(duì)離心力離心力和相對(duì)離心力 溶液中的固相顆粒做圓周運(yùn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生一個(gè)向外離心力，其定義為：F = m2r式中：F 為離心力的強(qiáng)度； m 為沉降顆粒的有效質(zhì)量； 為離心轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動(dòng)的角速度，其單位為rad/s；r 為離心半徑(cm)，即轉(zhuǎn)子中心軸到沉降顆粒之間的距離。很顯然，離心力隨著轉(zhuǎn)速和顆粒質(zhì)量的提高而加大，而隨著離心半徑的減小而降低。離心力通常以相對(duì)離心力Fcf 表示，即離心力F 的大小相對(duì)于地球引力(G)的多少倍，單位為g，其計(jì)算公式如下：Fcf = 1.119

5、105(h)2rg可以看出，在同一轉(zhuǎn)速下，由于f 的不同，F(xiàn)cf相差會(huì)很大，實(shí)際應(yīng)用時(shí)一般取平均值。在離心實(shí)驗(yàn)的報(bào)告中，F(xiàn)cf、r 平均、離心時(shí)間t 和液相介質(zhì)等條件都應(yīng)表示出來(lái)，因?yàn)樗鼈兌寂c樣品的沉降速度有直接的聯(lián)系。顯然Fcf是一個(gè)只與離心機(jī)相關(guān)的參數(shù)，而與樣品并無(wú)直接的關(guān)系。離心方法分類離心方法分類:1.差速離心法差速離心法:通過(guò)逐步增加相對(duì)離心力，使一個(gè)非均相混合液內(nèi)形狀不同的大小顆粒分步沉淀。2.密度梯度離心法：密度梯度離心法：1）速度區(qū)帶離心法2）預(yù)制梯度等密度離心法3）自成梯度等密度離心法3.沉降平衡離心法沉降平衡離心法:根據(jù)被分離物質(zhì)的浮力密度差別進(jìn)行分離，所用的介質(zhì)起始密度約

6、等于被分離物質(zhì)的密度，介質(zhì)在離心過(guò)程中形成密度梯度，被分離物質(zhì)沉降或上浮到達(dá)與之密度相等的介質(zhì)區(qū)域中停留并形成區(qū)帶。離心工具離心工具:離心機(jī)(centrifuge)是實(shí)施離心技術(shù)的裝置。離心機(jī)的種類很多，按照使用目的，可兩類，即制備型離心機(jī)和分析型離心機(jī)。前者主要用于分離生物材料，每次分離樣品的容量比較大，后者則主要用于研究純品大分子物質(zhì)，包括某些顆粒體如核蛋白體等物質(zhì)的性質(zhì)，每次分析的樣品容量很小，根據(jù)待測(cè)物質(zhì)在離心場(chǎng)中的行為(可用離心機(jī)中的光學(xué)系統(tǒng)連續(xù)地監(jiān)測(cè))，能推斷其純度、形狀和相對(duì)分子質(zhì)量等性質(zhì)。兩類離心機(jī)由于用途不同，故其主要結(jié)構(gòu)也有差異。通常所使用的離心機(jī)根據(jù)轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速大小的不同可分

7、為低速離心機(jī)、高速離心機(jī)和超速離心機(jī)三類。超速離心機(jī)高速離心機(jī)低速離心機(jī)實(shí)驗(yàn)器材與試劑實(shí)驗(yàn)器材與試劑:（一）器材小白鼠，研缽，手術(shù)剪，手術(shù)鑷子，移液管，可調(diào)式移液器，10ml離心管，低速離心機(jī)（二）試劑1. pH=7.4的磷酸緩沖液2. 0.25%琥珀酸鈉溶液3. 0.5%草酸鈉溶液4. 0.01%甲烯藍(lán)溶液5. 0.9生理鹽水實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作:1.肝糜液的制備:取小白鼠1只，頸椎脫臼法處死。剖腹將肝臟全部取出，置于研缽中，用生理鹽水洗凈肝臟中的血液。用剪刀剪碎肝臟，充分研碎至糊狀，然后分批加入少量磷酸緩沖液，邊加邊磨，共加入7ml。攪勻后倒入圓底離心管中，離心約3min(3000r/min)

8、。將上清液倒入一支試管中備用，此即為含有琥珀酸脫氫酶的肝糜液。2.另取中試管5支，標(biāo)號(hào)，按下表操作。表表5-5 琥珀酸脫氫酶活力的測(cè)定琥珀酸脫氫酶活力的測(cè)定試劑試劑/ml123450.25%琥珀酸鈉溶液0.500.502.000.500.5%草酸鈉溶液0.500.500.502.00蒸餾水2.002.001.50肝糜液1.001.001.001.001.00甲烯藍(lán)0.200.200.200.200.20注：甲烯藍(lán)的量可以根據(jù)肝糜液制備情況進(jìn)行調(diào)整搖勻，靜置于37的水浴中(此后再勿搖動(dòng))，注意觀察各管的顏色變化。記錄各管顏色消退的順序和時(shí)間，并分析原因。震蕩褪色的反應(yīng)液，觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象并分析產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng):1.本實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵是肝糜液的制備的質(zhì)量。肝臟一定要充分研磨至糊狀，以使琥珀酸脫氫酶盡量釋放到溶液里。2.離心時(shí)注意離心管一定要精確平衡，并將重要相等的離心管對(duì)稱放置3.離心結(jié)束后拿取離心管時(shí)動(dòng)作要輕柔，不要振蕩離心管，以免肝糜液重新變渾濁思考題思考題:1:為什么反應(yīng)開(kāi)始后，反應(yīng)液必須靜止，不能再搖動(dòng)?2:本實(shí)驗(yàn)為何選擇肝臟來(lái)提取琥珀酸脫氫酶？本實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵是什么？3：抑制劑還可以選用什么物質(zhì)？4：利用本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，說(shuō)明酶競(jìng)爭(zhēng)性抑制的特點(diǎn)？5：本試驗(yàn)在設(shè)計(jì)上存在某些缺陷，指出存在的