膜翅目昆蟲干標(biāo)本的基因組DNA提取

1、第27卷第4期2002年10月動物分類學(xué)報AC TA ZOO TAXONOMICA SIN ICA Vol.27,No.4Oct .,20023國家自然科學(xué)基金資助項目(編號39970099.收稿日期:20020402,修訂日期:20020420.672膜翅目昆蟲干標(biāo)本的基因組DNA 提取3樸美花陳學(xué)新何俊華(浙江大學(xué)應(yīng)用昆蟲學(xué)研究所杭州310029摘要提出了膜翅目昆蟲干標(biāo)本基因組DNA 的提取方法,通過對實驗結(jié)果和所測得的基因片段(28S D 2rDNA 的分析,表明該方法可行。關(guān)鍵詞基因組DNA ,膜翅目,干標(biāo)本,提取.中圖分類號Q 966近年來,昆蟲分子系統(tǒng)學(xué)和進(jìn)化研究迅猛發(fā)展,對昆蟲分

2、子系統(tǒng)發(fā)育中常利用的分子標(biāo)記如mtDNA 和rDNA 的測序要求快速有效,因此昆蟲中有效基因組DNA 的提取是重要的前提。許多研究者介紹的基因組DNA 的提取方法中所采用的材料基本上是新鮮樣品或超低溫冷凍標(biāo)本(Blin &Staff ord ,1976;Bowtell ,1987;Gross 2Bellardd et al.,1972;Kupiec et al.,1987;王文和施立明,1993,但是分子系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化研究中經(jīng)常出現(xiàn)所研究的類群,特別是稀有類群難以得到新鮮材料的問題,因此往往需要利用自然博物館或標(biāo)本館的干標(biāo)本提取基因組DNA ,但干標(biāo)本保存時間越長基因組DNA 的降解也

3、越嚴(yán)重。因此,如何從干標(biāo)本中提取基因組DNA 的方法對系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化研究至關(guān)重要。本文結(jié)合膜翅目寄生性種類分子系統(tǒng)發(fā)育研究,對干標(biāo)本中的基因組DNA 的提取方法進(jìn)行了探索。1材料和方法1.1材料浙江大學(xué)應(yīng)用昆蟲學(xué)研究所標(biāo)本館里保存的分別采于1987年(山東濟(jì)南,2頭、1980年(浙江奉化,2頭、1954年(湖南東安,2頭及1935年(江蘇宜興,2頭的松毛蟲脊繭蜂Aleiodes esenbecki Hartig (膜翅目:繭蜂科:內(nèi)繭蜂亞科干標(biāo)本。每次DNA 提取使用較完整的1頭松毛蟲內(nèi)繭蜂胸腹部及足,重復(fù)進(jìn)行2次。本實驗所采用的松毛蟲脊繭蜂標(biāo)本,采集時用KCN 毒死,陰干后制標(biāo)本,一直保存在

4、密封、控制濕度的標(biāo)本館里,因此采集及保存條件幾乎完全一致。112設(shè)備PCR 儀(TECHN E FPRO G 05D ,電泳儀(大連J M 2250,臺式高速冷凍離心機(jī)(SI GMA D 237520,恒溫金屬浴(大和CHB 2100,微波爐(GALAN Z ,勻漿器,紫外透射儀(TANON UV 2000,數(shù)碼相機(jī)及其附件(KODA K DC 120,紫外分光光度儀(PER KIN EL M ER MBA 2000。113基因組DNA 提取常規(guī)DNA 提取方法(Gross 2Bellard 等,1972通常是:取蟲體碾碎在37下用Pro K 培育1h 乙酸鈉/ETO H 沉淀溶于50ml M

5、illiQ H 2O -20保存。實踐表明:常規(guī)方法只適用于從新鮮標(biāo)本中提取基因組DNA ,而對干標(biāo)本卻不能獲得成功。為了從干標(biāo)本中提取基因組DNA ,筆者摸索了一套新方法,即在利用常規(guī)方法之前,進(jìn)行比較關(guān)鍵性的處理。具體步驟如下:圖1基因組DNA 的凝膠電泳圖譜(Gel electrop horesis pattern of genome DNA collected f rom dried specimens of Aleidesesenbecki 11采于1987年(in 198721采于1980年(in198031采于1954年(in 195441采于1935年(in 1935(2用沖洗

6、緩沖液(10mmol/L Tris Cl p H 810,100mmol/L NaCl ,1mmol/L MgCl 2沖洗23次;(3將蟲體(1頭昆蟲的胸腹部及足磨成粉末;(4加入分離緩沖液(10mmol/L Tris Cl p H 8.0,10mmol/L ED TA ,1%SDS ;(5再加入蛋白酶K ,37水中1h ;(6加入5mol/L NaCl 混勻,5000g 離心數(shù)秒;(7等體積酚氯仿異戊醇(25241反復(fù)抽提直到在界面上看不到蛋白質(zhì);(8加入1/10體積3mol/L NaAc (p H 512,再加入2倍體積的冰冷的100%乙醇,-20冰箱中放置015110h ;(950l M

7、illiQ H 2O 溶解DNA 。114PCR 反應(yīng)反應(yīng)體系為:50l 體積,包括500ng 以上的模板DNA ,015l 215U Taq 酶(Promega ,5l 10×buffer ,4l 25mmol/L MgCl 2,1l 20mol/L Primers ,5l 2mmol/L dN TPs (Promega 。引物:引用Dowton &Austin (1998所采用的引物:擴(kuò)增28S D 2rDNA 片段的PCR 條件:94變性3min 30循環(huán)(94變性30s 54,退火1min 72延伸1min 72延伸8min ,獲得的28S D 2rD 2NA 片段長

8、度為475bp 。從反應(yīng)混合液中取出8l 擴(kuò)增產(chǎn)物用118%瓊脂糖凝膠(上海東海制藥廠進(jìn)行電泳分析。2結(jié)果與分析211不同保存時間干標(biāo)本中提取的基因組DNA 電泳結(jié)果圖1中,采用本文3中敘述的干標(biāo)本基因組DNA 的提取方法提取了基因組DNA ,可以看到1和2有較亮3764期樸美花等:膜翅目昆蟲干標(biāo)本的基因組DNA 提取的帶,而3和4很難看到亮帶,說明采于1987年和1980年的松毛蟲脊繭蜂干標(biāo)本中提取的基因組DNA量較高,而采于1954年和1935年的松毛蟲脊繭蜂干標(biāo)本中抽提的基因組DNA量極少。212用紫外分光光度計測得的OD值表1不同保存時間干標(biāo)本提取物的OD值(Op tical de n

9、sit y of drie d sp eci me ns of DNA af te r diff e re nt le ngt hs of p rese rvation保存時間14年(采于1987年21年(采于1980年47年(采于1954年66年(采于1935年表1中,看到采于1987年的松毛蟲脊繭蜂干標(biāo)本的基因組DNA得率最高,為312ng/l,采于1935年的松毛蟲脊繭蜂干標(biāo)本的基因組DNA得率最低,為015ng/l,表明保存時間長基因組DNA得率明顯下降。213新鮮標(biāo)本和干標(biāo)本的基因組DNA擴(kuò)增圖2中,利用新鮮標(biāo)本基因組DNA提取方法抽提干標(biāo)本基因組DNA,然后進(jìn)行28S D2 rDN

10、A片段的PCR擴(kuò)增反應(yīng),可以看到3有亮帶,而1和2無亮帶。說明新鮮標(biāo)本的基因組DNA提取方法不適合于干標(biāo)本基因組DNA的抽提。因此探索了干標(biāo)本中基因組DNA提取方法。214不同保存時間干標(biāo)本的DNA擴(kuò)增圖3中,基因組DNA提取方法采用了本文中敘述的干標(biāo)本DNA的提取方法,然后進(jìn)行28S D2rDNA片段的PCR擴(kuò)增反應(yīng),可以看到1和2有亮帶,3和4無亮帶。說明采于1987年和1980年的松毛蟲脊繭蜂干標(biāo)本中抽提的基因組DNA的PCR擴(kuò)增得到成功,但采于1954年和1935年的松毛蟲脊繭蜂干標(biāo)本的實驗失敗,失敗原因可能是采于1954年和1935年干標(biāo)本中沒有完整的基因組DNA。3討論通過實驗總結(jié)

11、出了從干標(biāo)本中提取基因組DNA的非常關(guān)鍵的處理措施。首先,在S TE 緩沖液中浸漬干標(biāo)本數(shù)小時,然后再用沖洗緩沖液沖洗23次,這是從干標(biāo)本中提取基因組DNA的重要環(huán)節(jié)。因為長時間保存在標(biāo)本館或博物館里的干標(biāo)本中,基因組DNA的降解嚴(yán)重并且存在影響PCR擴(kuò)增的因素,所以此方法在基因組DNA提取中大大減少基因組DNA的機(jī)械斷裂和其它阻斷劑,有利于保護(hù)干標(biāo)本基因組DNA,減輕或排除對PCR擴(kuò)增反應(yīng)的影響。依此方法對采于1980年和1987年的松毛蟲脊繭蜂干標(biāo)本進(jìn)行了實驗,基因組DNA的提取、PCR擴(kuò)增及測序均獲得了成功,而對采于1935年和1954年的干標(biāo)本的上述實驗均未獲得成功,表明該方法適于對2

12、0年以內(nèi)的干標(biāo)本的基因組DNA的提取。本研究工作對分子系統(tǒng)學(xué)和進(jìn)化研究將具有重要意義,能夠充分利用標(biāo)本室歷年來積累的標(biāo)本,縮短研究時間,節(jié)省人力和物力。476動物分類學(xué)報27卷 圖3不同保存時間干標(biāo)本DNA 的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物(28S D 2rDNA 片段的凝膠電泳圖譜(The gel electrop horesis pattern of PCR amplification p roduct (28S D 2rDNA gene f ragment of dried speci 2mens of DNA of after different lengths of p reseration ti

13、me ,collected f rom Aleiodes esenbecki 1.采于1987年(in 19872.采于1980年(in 19803.采于1954年(in 19544.采于1935年(in 1935M 標(biāo)準(zhǔn)分子量(marker 圖2新鮮標(biāo)本和干標(biāo)本DNA 的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物(28S D 2rDNA 片段的凝膠電泳圖譜(The gel electrop horesis pattern of the PCRamplification p roduct (28S D 2rDNA genef ragment of f resh and dried specimens of DNA 1.

14、采于1987年的松毛蟲脊繭蜂干標(biāo)本(Aleiodes microc 2ulat us dried specimens collected in 19872.采于1980年的松毛蟲脊繭蜂干標(biāo)本(Aleiodes esenbecki dried speci 2mens collected in 19803.采于2000年的黑脊繭蜂新鮮標(biāo)本(Aleiodes esenbecki f resh specimens collected in2000M 標(biāo)準(zhǔn)分子量(marker 參Biochem ,36:32.王文,施立明,1993.一種改進(jìn)的動物線立體DNA 提取方法.動物學(xué)研究,14(2:197198

15、5764期樸美花等:膜翅目昆蟲干標(biāo)本的基因組DNA 提取676動物分類學(xué)報27卷EX T RAC TIO N O F GEN O M E DNA FRO M D RI ED S P ECIM ENS O F H YM EN O P T ERAN INS EC TS(INS EC TAPIAO Mei2HuaCHEN Xue2XinHE J un2Hua(Instit ute of Applied Entomology,Zhejia ng University,Ha ngzhou310029,Chi naA bs t r actAn effective method of extracting

16、genome DNA f rom dried specimens is important f or the study of molecular p hylogenitics and evolution in insects.This paper deals with methods of ex2 tracting genome DNA f rom dried specimens of Hymenoptera,using PCR apparatus to amplif y and sequence the28S D2rDNA gene segment.DNA extraction was d

17、one as f ollows:soaking of material in S TE buffer f or5h,washing223times with10mmol/L TrisCl(p H810,100mmol/ L NaCl,1mmol/L MgCl2,grinding,addition of600l10mmol/L TrisCl(p H8.0+10mmol/ L ED TA+1%SDS+100g of Proteinase K heated to37f or1h.The homogenate was ex2 tracted with p henol and the genome DN

18、A p recipitated with2volumes of ethanol.DNA was redis2 olved in50l of sterile water and stored at-20.PCRs were carried out in50l volumes con2 taining015l DNA extracts,2.5U Boehringer Taq polymerase,5.0l Boehringer Taq buffer, 2mmol/L dN TPs,16mol/L p rimer(adopted Dowton and Austin(1998p rimersand25

19、 mmol/L MgCl2.Cycling conditions were thirty cycles of94denaturation(30s,54anneal2 ing(1minand72extension(1min,with an initial denaturation of3min at94and a final extension of72f or8min.The result shows that genome DNA couldle be successf ully extacted f rom Aleiodes esenbecki dried specimens collec