神經(jīng)HRP示蹤顯色液(DAB法)

1、神經(jīng)HRP示蹤顯色液(DAB法簡介：上個世紀70年代，Kristensopn和Olsson報道了HRP可神經(jīng)末梢攝取，經(jīng)軸漿逆行運輸至神經(jīng)元胞體，經(jīng)組織化學方法可顯示出神經(jīng)元的輪廓，從而開發(fā)出HRP追蹤神經(jīng)元示蹤技術(shù)，即為HRP法。DAB即3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride, 是辣根過氧化物酶的常用底物。在辣根過氧化物酶的催化下, DAB會產(chǎn)生棕色沉淀，該棕色沉淀不溶于水和乙醇，顯色后呈棕色，可在顯微鏡下觀察。Leagene 神經(jīng)HRP示蹤顯色液(DAB法是動物經(jīng)麻醉、注入HRP后，游離或絡(luò)合型的HRP與氧化劑反應生成絡(luò)合物，該絡(luò)合物氧化供氫的D

2、AB顯色劑，呈棕色，在顯微鏡下清晰可見。該顯色液僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。組成：編號名稱DK004650TStorage試劑(A: DAB assay buffer2×500mlRT 避光試劑(B: DAB顯色液30ml-20 避光試劑(C: DAB增強劑2×1mlRT試劑(D: DAB Wash buffer(20×100mlRT使用說明書1份操作步驟(僅供參考：(一、準備工作1、動物麻醉：多用(3.5%戊巴比妥鈉作為麻醉劑，大鼠的麻醉劑量。2、導入HRP：有壓力注射法、電泳法以及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的注射涂抹等法。3、確定動物存活期。4、動物灌注：麻

3、醉后，經(jīng)左心室升主動脈插管行心內(nèi)灌注固定。先用生理鹽水或PBS快速灌注。隨后用多聚甲醛固定液灌注，先快后慢，時間控制在30-40min。最后用蔗糖磷酸緩沖液(pH7.4。5、取材：取組織置于蔗糖磷酸鹽緩沖液中，切片，存于蔗糖磷酸鹽緩沖液備用。(二、顯色反應1、配制DAB孵育液：取適量的DAB assay buffer和DAB顯色液，DAB assay buffer：DAB顯色液按一定的比例混合，即為DAB孵育液，即配即用，不宜保存。2、配制DAB顯色工作液：取適量的DAB孵育液和DAB增強劑，DAB孵育液：DAB增強劑按一定的比例混合(具體比例應根據(jù)具體時間摸索確定，即為DAB顯色工作液，即配

4、即用，不宜保存。3、配制1×DAB Wash buffer：取適量的DAB Wash buffer(20×，DAB Wash buffer：蒸餾水按一定的比例混合，即為1×DAB Wash buffer。室溫保存，6月有效。4、切片用蒸餾水清洗。5、切片入DAB孵育液(提前20溫育，避光孵育，其間不斷晃動。6、切片入DAB顯色工作液(提前20溫育，避光孵育，其間不斷晃動。7、漂洗：取1×DAB Wash buffer漂洗切片。8、貼片，載玻片用鉻明礬明膠包被，室溫空氣干燥。9、脫水、透明步驟按如下操作：蒸餾水 10s70%乙醇 10s95%乙醇 10s100%乙醇 2次，每次10s二甲苯 2次，每次25min。10、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察棕色反應。注意事項：1、 如果出現(xiàn)高的反應背景或沉淀，表明DAB底物反應過于強烈。2、 所用器皿必須潔凈，避免含有氧化劑或還原劑，否則會產(chǎn)生非特異性反應。3、 DAB顯色液避免反復凍融，以免顯色效率下降。4、 DAB增強劑注意密閉保存，否則顯色效率下降。有效期： 12個月內(nèi)有效。編號名稱CC0007磷酸緩沖鹽溶液(10×PBS,無鈣鎂CS0001ACK紅細胞裂解液(ACK Lysis BufferDC0032Masson三色染色液DF0