胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程(SOP)

1、一、細(xì)胞多能性胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生于小鼠胚泡1.表達(dá)綠色熒光蛋白(EGFP的B5-ES細(xì)胞。由Dr. Nagy的實(shí)驗(yàn)室制備。2.D3-ATCC; CRL-1934. 我們得到時(shí)大約傳了17代。3.J1-由Dr. Jaenish的實(shí)驗(yàn)室友情提供。我們得到時(shí)大約傳了7-9代。4.J1rtTA-rtTA表達(dá)J1細(xì)胞,由Dr. Jaenish的實(shí)驗(yàn)室友情提供。5.表達(dá)黃色熒光蛋白的YC5-ES細(xì)胞,由Dr. Nagy的實(shí)驗(yàn)室提供。二、一般培養(yǎng)維持ES細(xì)胞處于未分化狀態(tài)ES細(xì)胞培養(yǎng)用含有ESGRO(白血病抑制因子的高糖培養(yǎng)基來(lái)阻止細(xì)胞的分化。為細(xì)胞提供包被有0.1%明膠的平板作為粘附細(xì)胞的基質(zhì)。建議每2-3天

2、從達(dá)到80%-90%融合的平板按1:8的比率傳代細(xì)胞一次,細(xì)胞傳代以后,在將細(xì)胞接種在0.1%明膠包被的培養(yǎng)皿之前,通過(guò)預(yù)先將細(xì)胞接種在沒(méi)有經(jīng)過(guò)包被的組織培養(yǎng)板2個(gè)小時(shí),使分化細(xì)胞粘附,從而將分化和未分化細(xì)胞分開(kāi)。將細(xì)胞全程置于37,5%CO2,100%濕度條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)基ES:配制一20×不含DMEM,HS,ESGRO的溶液(該溶液也能用于EB培養(yǎng)基-見(jiàn)下文。分裝在50ml FALCON管中,(稀釋為2×,每管42ml,貯存在-20。通過(guò)將21ml該溶液,HS 和ESGRO加入450mlDMEM中制備培養(yǎng)基,0.2m濾膜過(guò)濾。貯存于4。注:一瓶DMEM 是500ml。貯

3、存液DMEM(高糖馬血清(HSL-谷氨酰胺(200mMMEM NEAA(10mMHEPES(1M-巰基乙醇(55MmPESTESGRO復(fù)蘇細(xì)胞細(xì)胞被凍存在10%二甲基亞砜(DMSO中防止結(jié)晶的形成,結(jié)晶的形成會(huì)損害細(xì)胞。然而,二甲基亞砜對(duì)細(xì)胞有毒性,快速的進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇是很重要的。步驟1.從液氮中取出一管細(xì)胞;2.將凍存管置于37水浴中2分鐘(或放到管內(nèi)溶液恰好完全溶解;3.將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一15ml Falcon管中;4.加入5ml ES培養(yǎng)基(用培養(yǎng)基沖洗凍存管;5.離心3分鐘;6.棄上清,用2ml ES培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,至少吹打10次;7.接種在明膠包被(見(jiàn)下文的6孔或6cm組織培養(yǎng)皿;8.孵育

4、。凍存細(xì)胞凍存液:90%HS和10%二甲基亞砜步驟:1.1×PBS洗細(xì)胞并留少許PBS在培養(yǎng)皿內(nèi);2.用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞;3.將細(xì)胞轉(zhuǎn)入15ml Falcon管內(nèi)并離心3分鐘;4.棄去上清并將細(xì)胞重懸于冷的凍存液中(10cm的培養(yǎng)皿用2ml,15cm的培養(yǎng)皿用6 7ml。5.分裝于凍存管內(nèi),每管1ml;6.置-80過(guò)夜,第二天移入液氮。明膠包被準(zhǔn)備500ml 0.1%明膠溶液包被培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿1.加入足量的明膠溶液覆蓋培養(yǎng)平面(15cm培養(yǎng)皿加2ml,10cm培養(yǎng)皿加0.51ml,溶液的量并不重要,只要能完全覆蓋培養(yǎng)表面就行了;2.置室溫30分鐘;3.去除明膠溶液,將培養(yǎng)板貯存在包裝

5、袋中室溫放置,最好將板子平方,以免明膠污染蓋子和流出培養(yǎng)板。細(xì)胞傳代建議每2-3天傳代細(xì)胞一次,過(guò)度生長(zhǎng)的細(xì)胞會(huì)降低細(xì)胞的自然分化率,我們建立了一種純化方法來(lái)去除分化細(xì)胞,在將細(xì)胞接種在明膠包被的培養(yǎng)板上之前,通過(guò)將分化細(xì)胞黏附在沒(méi)有包被的組織培養(yǎng)板上去除分化細(xì)胞。純化步驟包含在下面的方法中。1.去除培養(yǎng)液;2.1×無(wú)鈣鎂PBS洗滌;3.加入1×胰酶EDTA(10×胰酶EDTA用PBS稀釋。37孵育5分鐘。4.加入ES培養(yǎng)基使胰酶失活;5.將細(xì)胞轉(zhuǎn)入15ml離心管中離心3min;6.去除上清,將細(xì)胞重懸于2mlES培養(yǎng)基,至少吹打10-20次。如果加入培養(yǎng)基的量較

6、少會(huì)比較容易將細(xì)胞團(tuán)弄散分開(kāi)。ES細(xì)胞有聚集成團(tuán)的傾向,傳代過(guò)程中仔細(xì)將細(xì)胞弄散分開(kāi)很重要。這樣可能會(huì)減少細(xì)胞的自然分化。7.將細(xì)胞接種在沒(méi)有包被的組織培養(yǎng)皿中(使用和一開(kāi)始同樣規(guī)格的培養(yǎng)皿放入溫箱2小時(shí)(分化細(xì)胞在該時(shí)間內(nèi)將黏附,而ES細(xì)胞仍將保持懸浮;8.將含有細(xì)胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入明膠包被(見(jiàn)下文的組織培養(yǎng)皿。吹打以確保細(xì)胞被分散開(kāi)(前面已經(jīng)提到-ES細(xì)胞有聚集成團(tuán)的傾向9.建議按1:4-1:10的比率傳代(ATCC保持細(xì)胞的傳代比率很重要,以我們的經(jīng)驗(yàn),1:8的比率是好的,可以使細(xì)胞的自然分化降到最低。當(dāng)你使用不同規(guī)格的培養(yǎng)板進(jìn)行細(xì)胞傳代可以使用表1來(lái)計(jì)算傳代比率。三、體外分化多能胚胎干細(xì)胞

7、在體內(nèi)外可以分化為各種類型的細(xì)胞。我們的體外分化方法有利于神經(jīng)前體細(xì)胞通過(guò)在最少量的培養(yǎng)基內(nèi)選擇(第3步,在有bFGF存在的情況下擴(kuò)增(第4步并最終分化在第5步。細(xì)胞全程培養(yǎng)在37,5%CO2,100%濕度條件下。時(shí)間線(總時(shí)間為2734天第2步:4+1天;第3步:410天;第4步:4天;第5步:1015天培養(yǎng)基EB配制一20×不含DMEM,FBS,ESGRO的溶液(該溶液也能用于ES培養(yǎng)基-見(jiàn)前述。分裝在50ml FALCON管中,(稀釋為2×,每管42ml,貯存在-20。將21ml該溶液和50ml FBS加入450mlDMEM中制備培養(yǎng)基,0.2m濾膜過(guò)濾。貯存于4。注

8、:一瓶DMEM是500ml。貯存液DMEM(高糖胎牛血清L-谷氨酰胺(200mMMEM NEAA(10mMHEPES(1M-巰基乙醇(55MmPEST(P104U/mlS104g/mlITSFn and N3:(稀釋為1×,ITSFn 7.05ml,配制一20×不含DMEM/F12的溶液。分裝在15ml FALCON管中,N3 12.55ml,0.2m濾膜過(guò)濾,貯存在-20。將該溶液加入DMEM/F12中制備培養(yǎng)基,貯存于4。貯存液DMEM(高糖轉(zhuǎn)鐵蛋白50mg/ml胰島素5mg/ml亞硒酸鈉300M黃體酮(20M腐胺(100MPEST(P104U/ml S104g/ml層

9、粘連蛋白100g/ml纖維連接蛋白250g/ml堿性rhFGF, 10g/ml*在第4步將bFGF加入N3培養(yǎng)基使終濃度為10ng/ml。ITSFn and N3培養(yǎng)基貯存液的準(zhǔn)備使用無(wú)菌的溶劑和稀釋液,在分裝之前要對(duì)溶液進(jìn)行過(guò)濾,如果因?yàn)槟承┰蛉芤涸诜盅b之前沒(méi)有進(jìn)行過(guò)濾,需要在管子上標(biāo)明以便別人在使用時(shí)知道該溶液不能直接用于細(xì)胞培養(yǎng)。貯存液,溶劑,貯存液,稀釋劑和儲(chǔ)存轉(zhuǎn)鐵蛋白50mg/ml胰島素5mg/ml亞硒酸鈉300M黃體酮(20M腐胺(100MPEST(P104U/ml S104g/ml層粘連蛋白(100g/ml纖維連接蛋白(250g/ml 堿性rhFGF, (10g/ml包被有多聚

10、鳥(niǎo)氨酸/纖維結(jié)合蛋白的培養(yǎng)板(使用或不使用蓋玻片包被液的準(zhǔn)備多聚-L-鳥(niǎo)氨酸,15g/ml把75ml多聚-L-鳥(niǎo)氨酸和425ml 1×PBS混合。貯存在4。纖維結(jié)合蛋白,1g/ml把0.5ml纖維結(jié)合蛋白和500ml 1×PBS混合。包被過(guò)程:1.加入多聚-L-鳥(niǎo)氨酸,至少23小時(shí)(過(guò)夜也行2.吸出多聚-L-鳥(niǎo)氨酸3.加入纖維結(jié)合蛋白,大約12小時(shí)4.吸出纖維結(jié)合蛋白,放置30分鐘晾干5.貯存在424孔板用200l,6孔板用500l。震蕩培養(yǎng)板確保溶液能夠覆蓋蓋玻片或培養(yǎng)孔。有時(shí)需要?jiǎng)×艺鹗幣囵B(yǎng)板。體外分化方法第1步:ES培養(yǎng)基在LIF(ESGRO存在的條件下維持細(xì)胞培養(yǎng)第

11、2步:EB培養(yǎng)基使用細(xì)菌培養(yǎng)皿去除LIF后胚狀體的形成需要4天。1.分散純化細(xì)胞(參見(jiàn)上面的細(xì)胞傳代部分2.純化2小時(shí)后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有ES培養(yǎng)基的50ml Falcon管中,計(jì)數(shù)細(xì)胞取適量體積放入15ml管中離心3分鐘。3.用2mlEB培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,吹打至少10次制成單細(xì)胞懸液4.一個(gè)15cm的細(xì)菌培養(yǎng)皿接種45×106個(gè)細(xì)胞(1個(gè)完全融合的組織培養(yǎng)皿通常足以接種4個(gè)同樣規(guī)格的細(xì)菌培養(yǎng)皿。5.2天后更換培養(yǎng)基將胚狀體轉(zhuǎn)入錐形管中放置35分鐘使細(xì)胞沉降。棄去上清,將細(xì)胞重懸于新鮮培養(yǎng)基并接種在新的細(xì)菌培養(yǎng)皿中。6.用EB培養(yǎng)基培養(yǎng)的第4天將細(xì)胞轉(zhuǎn)入沒(méi)有包被的組織培養(yǎng)皿中(這即是細(xì)胞的

12、移植步驟。1個(gè)組織培養(yǎng)皿之中放置1個(gè)細(xì)菌培養(yǎng)皿,在進(jìn)行第3步之前一天將胚狀體黏附在同樣規(guī)格的培養(yǎng)板上。形成胚狀體需要4天時(shí)間。在EB培養(yǎng)基中再培養(yǎng)1天使胚狀體粘附在組織培養(yǎng)皿的表面。這一天被認(rèn)為是第2步和第3步的分界。第3步:ITSFn培養(yǎng)基在最少量培養(yǎng)基中選擇神經(jīng)前體細(xì)胞1.在胚狀體接種在組織培養(yǎng)皿一天后將培養(yǎng)基換成ITSFn培養(yǎng)基2.并非所有胚狀體在這一時(shí)期都已經(jīng)發(fā)生粘附,因此在移除培養(yǎng)基時(shí)要小心謹(jǐn)慎以使大部分胚狀體留在培養(yǎng)皿內(nèi)。3.保持細(xì)胞在ITSFn中培養(yǎng)大約10天,根據(jù)需要更換培養(yǎng)基-大約每隔一天。觀察細(xì)胞形態(tài),神經(jīng)樣細(xì)胞大約出現(xiàn)在第4到第7天。當(dāng)神經(jīng)樣細(xì)胞能夠被鑒別時(shí),轉(zhuǎn)入到第4步

13、。步驟的轉(zhuǎn)換應(yīng)該在神經(jīng)前體細(xì)胞出現(xiàn)第一個(gè)清晰的標(biāo)志幾天以后,通常是在第3步的第6到第10天。第4步:N3培養(yǎng)基+bFGF通過(guò)將神經(jīng)前體細(xì)胞培養(yǎng)在含有10ng/ml bFGF的培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增。1.PBS洗滌,加入2ml 1×胰酶(1個(gè)15cm的培養(yǎng)皿所需胰酶的量根據(jù)前文表中的體積(10×胰酶EDTA用PBS稀釋2.37孵育5分鐘3.用4mlEB培養(yǎng)基終止胰酶活性,將細(xì)胞轉(zhuǎn)入錐形管中放置35分鐘移出細(xì)胞團(tuán),將上清移入一新的離心管離心。4.將細(xì)胞重懸于含有bFGF的N3培養(yǎng)基。5.將細(xì)胞接種在包被多聚-L-鳥(niǎo)氨酸/纖維連接蛋白的蓋玻片上(最好將蓋玻片放于24孔培養(yǎng)板或6孔培養(yǎng)板

14、,6孔培養(yǎng)板中每孔放置5個(gè)蓋玻片如果是塑料的放置4個(gè),以使最大可能的獲得樣品數(shù)量。24孔板接種3.5×105/孔或6孔板1.7×106/孔。6.2天后更換培養(yǎng)基第5步:N3培養(yǎng)基通過(guò)撤除bFGF使神經(jīng)前體細(xì)胞分化1.細(xì)胞被接種在蓋玻片上4天后將培養(yǎng)基換成不含bFGF的N3培養(yǎng)基2.根據(jù)需要換液(大約每隔一天3.分化1015天后固定細(xì)胞移除培養(yǎng)基PBS洗滌加入4%福爾馬林室溫放置30分鐘PBS洗滌2次儲(chǔ)存于PBS。長(zhǎng)期儲(chǔ)存使用含0.01%疊氮化納的PBS四、移植細(xì)胞的準(zhǔn)備細(xì)胞在胚狀體形成4天以后被移植(相應(yīng)于體外分化過(guò)程中的第2步末細(xì)胞被轉(zhuǎn)種到組織培養(yǎng)板。正如在前文體外分化中

15、所描述的在移植之前4天開(kāi)始形成胚狀體。通常再需要一天時(shí)間以便將胚狀體移植入一10cm的培養(yǎng)皿。移植1.將胚狀體轉(zhuǎn)移至一15ml 圓錐形管中放置35分鐘使胚狀體沉降下來(lái)。細(xì)胞被離心3分鐘會(huì)更好。放置使之沉降將會(huì)去除更多的單個(gè)細(xì)胞(包括死細(xì)胞而這些細(xì)胞可以被離心下來(lái)。2.去除上清將胚狀體重懸于無(wú)鈣鎂離子的1×PBS中3.離心3分鐘4.去除上清加入1×胰酶(10cm的培養(yǎng)皿加1ml5.37水浴5分鐘6.加入5mlEB培養(yǎng)基小心吹打約10次小心處理細(xì)胞很重要,進(jìn)行細(xì)胞傳代分散細(xì)胞時(shí)不可劇烈吹打。7.離心2分鐘8.吸出上清將細(xì)胞重懸于500l EB培養(yǎng)基9.用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次10.離心2次11.吸出上清將細(xì)胞重懸于100l EB培養(yǎng)基煙酸己可堿標(biāo)記ES細(xì)胞進(jìn)行移植1.準(zhǔn)備一10g/ml的煙酸已