實(shí)驗(yàn)九：雞胚成纖維細(xì)胞的制備

1、實(shí)驗(yàn)九實(shí)驗(yàn)九 雞胚成纖維細(xì)胞的制備雞胚成纖維細(xì)胞的制備一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握雞胚成纖維細(xì)胞的制備和培養(yǎng)方法；學(xué)習(xí)和掌握雞胚成纖維細(xì)胞的制備和培養(yǎng)方法；了解原代細(xì)胞培養(yǎng)的原理和方法。了解原代細(xì)胞培養(yǎng)的原理和方法。二、試驗(yàn)器具、試劑、儀器二、試驗(yàn)器具、試劑、儀器 超凈工作臺(tái)，檢卵燈，滅菌的細(xì)胞培養(yǎng)瓶、眼科剪、眼科超凈工作臺(tái)，檢卵燈，滅菌的細(xì)胞培養(yǎng)瓶、眼科剪、眼科鑷、平皿、吸管、離心管等；鑷、平皿、吸管、離心管等；9-11日齡雞胚；日齡雞胚；Hanks液，液，0.25%胰酶消化液，雙抗（胰酶消化液，雙抗（10000IU/ml青鏈霉素），青鏈霉素），7.5%NaHCO3溶液，溶液，DMEM

2、營(yíng)養(yǎng)液，營(yíng)養(yǎng)液，75%酒精棉。酒精棉。三、實(shí)驗(yàn)原理三、實(shí)驗(yàn)原理 病毒能在易感的組織或單層細(xì)胞內(nèi)增殖，并可病毒能在易感的組織或單層細(xì)胞內(nèi)增殖，并可產(chǎn)生細(xì)胞病變，因此，細(xì)胞培養(yǎng)是病毒學(xué)研究的重產(chǎn)生細(xì)胞病變，因此，細(xì)胞培養(yǎng)是病毒學(xué)研究的重要手段，是進(jìn)行病毒性疫苗生產(chǎn)和病毒性疾病診斷要手段，是進(jìn)行病毒性疫苗生產(chǎn)和病毒性疾病診斷必不可少的工具。原代細(xì)胞培養(yǎng)是體外制備細(xì)胞培必不可少的工具。原代細(xì)胞培養(yǎng)是體外制備細(xì)胞培養(yǎng)物的必經(jīng)過(guò)程，從供體體內(nèi)取出組織分散成單個(gè)養(yǎng)物的必經(jīng)過(guò)程，從供體體內(nèi)取出組織分散成單個(gè)細(xì)胞接種于培養(yǎng)液中為初次培養(yǎng)，從初次培養(yǎng)到第細(xì)胞接種于培養(yǎng)液中為初次培養(yǎng)，從初次培養(yǎng)到第一次傳代培養(yǎng)為原

3、代培養(yǎng)。一次傳代培養(yǎng)為原代培養(yǎng)。 本實(shí)驗(yàn)以雞胚成纖維細(xì)胞作為原代細(xì)本實(shí)驗(yàn)以雞胚成纖維細(xì)胞作為原代細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)踐操作，認(rèn)識(shí)和體胞，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)踐操作，認(rèn)識(shí)和體會(huì)原代細(xì)胞的制備方法和影響細(xì)胞培養(yǎng)會(huì)原代細(xì)胞的制備方法和影響細(xì)胞培養(yǎng)的主要因素，并掌握原代細(xì)胞培養(yǎng)的方的主要因素，并掌握原代細(xì)胞培養(yǎng)的方法。法。四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟 （一）操作前的準(zhǔn)備（一）操作前的準(zhǔn)備1、預(yù)熱培養(yǎng)液：把已經(jīng)配制好的生長(zhǎng)液、預(yù)熱培養(yǎng)液：把已經(jīng)配制好的生長(zhǎng)液、Hanks 液和胰蛋白酶液放入液和胰蛋白酶液放入37水浴鍋內(nèi)預(yù)熱；水浴鍋內(nèi)預(yù)熱；2、用、用75%酒精棉擦拭雙手和紫外線照射過(guò)的超凈酒精棉擦拭雙手和紫外線照射

4、過(guò)的超凈 工作臺(tái)；工作臺(tái)；3、正確擺放要使用的器械：保證足夠的操作空、正確擺放要使用的器械：保證足夠的操作空 間，不僅便于操作而且可減少污染；間，不僅便于操作而且可減少污染；4、點(diǎn)燃酒精燈、點(diǎn)燃酒精燈.（二）雞胚成纖維細(xì)胞的制備（二）雞胚成纖維細(xì)胞的制備1、雞胚的處理、雞胚的處理（1）蛋殼消毒）蛋殼消毒 取取9-11日齡的雞胚，用檢卵燈選取血管清楚、日齡的雞胚，用檢卵燈選取血管清楚、活動(dòng)正常的雞胚，置蛋架上，令氣室端向上，活動(dòng)正常的雞胚，置蛋架上，令氣室端向上，75%酒精棉消毒蛋殼氣室部位。酒精棉消毒蛋殼氣室部位。（2）胚體采集）胚體采集 以鑷子擊破卵殼氣室部位，并除去該部位卵殼。以鑷子擊破卵

5、殼氣室部位，并除去該部位卵殼。用無(wú)菌的眼科鑷子撕開蛋殼氣室膜并小心撥開絨毛用無(wú)菌的眼科鑷子撕開蛋殼氣室膜并小心撥開絨毛尿囊膜和羊膜，鉤住雞胚頭部，移入滅菌的平皿內(nèi)。尿囊膜和羊膜，鉤住雞胚頭部，移入滅菌的平皿內(nèi)。用剪刀剪去胚頭、四肢及內(nèi)臟，用用剪刀剪去胚頭、四肢及內(nèi)臟，用Hanks液洗去體液洗去體表血液，移入滅菌小燒杯中。表血液，移入滅菌小燒杯中。（3）胚體勻漿）胚體勻漿 用滅菌剪將胚體剪碎至用滅菌剪將胚體剪碎至1mm3小碎塊。加小碎塊。加入入Hanks液（淹住組織碎塊即可），輕搖，靜液（淹住組織碎塊即可），輕搖，靜置置1-2min，待組織塊下沉，吸去上層懸液。，待組織塊下沉，吸去上層懸液。重復(fù)

6、重復(fù)2-3次（以除去其中的紅細(xì)胞），至上懸次（以除去其中的紅細(xì)胞），至上懸液不混濁為止，移入滅菌的小三角瓶中，吸去液不混濁為止，移入滅菌的小三角瓶中，吸去Hanks液。液。2、分散細(xì)胞、分散細(xì)胞（1）胰酶消化）胰酶消化 取出預(yù)熱好的取出預(yù)熱好的0.25%胰酶，向三角瓶中加入約胰酶，向三角瓶中加入約8mL。包緊瓶口，包緊瓶口，37消化消化30min，每隔，每隔5min輕輕搖動(dòng)輕輕搖動(dòng)1次。次。由于胰酶的作用，雞胚細(xì)胞與細(xì)胞間的氨基和羧基游由于胰酶的作用，雞胚細(xì)胞與細(xì)胞間的氨基和羧基游離。待液體變混而稍稠，輕搖可見組織塊懸浮在液體離。待液體變混而稍稠，輕搖可見組織塊懸浮在液體內(nèi)不易下沉，此時(shí)可中止

7、消化。如再繼續(xù)消化，可破內(nèi)不易下沉，此時(shí)可中止消化。如再繼續(xù)消化，可破壞細(xì)胞膜而不易貼壁生長(zhǎng)，如果消化不夠，則細(xì)胞不壞細(xì)胞膜而不易貼壁生長(zhǎng)，如果消化不夠，則細(xì)胞不易分散。易分散。（2）分散細(xì)胞）分散細(xì)胞 將消化好的細(xì)胞懸液從水浴鍋中取出，棄去上層將消化好的細(xì)胞懸液從水浴鍋中取出，棄去上層液體，加液體，加5mL含血清的含血清的DMEM生長(zhǎng)液（生長(zhǎng)液（DMEM營(yíng)養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)液+5%犢牛血清犢牛血清+100IU/ml青鏈霉素，用青鏈霉素，用7.5%NaHCO3溶液調(diào)溶液調(diào)pH7.2），以吸管反復(fù)吹吸數(shù)次，使細(xì)胞分散，），以吸管反復(fù)吹吸數(shù)次，使細(xì)胞分散，此時(shí)可見生長(zhǎng)液混濁，即為細(xì)胞懸液。靜置此時(shí)可見生長(zhǎng)液

8、混濁，即為細(xì)胞懸液。靜置1min后，后，使未沖散的組織塊下沉。使未沖散的組織塊下沉。（3）過(guò)濾）過(guò)濾 用用4層脫脂紗布將吹打后的細(xì)胞過(guò)濾到平皿中，層脫脂紗布將吹打后的細(xì)胞過(guò)濾到平皿中，收集濾液。收集濾液。（三）分裝與培養(yǎng)（三）分裝與培養(yǎng)1、細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞計(jì)數(shù) 用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，加入用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，加入DMEM生長(zhǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度至生長(zhǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度至50萬(wàn)萬(wàn)-60萬(wàn)個(gè)萬(wàn)個(gè)/ml。（本實(shí)驗(yàn)省略此步）。（本實(shí)驗(yàn)省略此步）2、分裝與培養(yǎng)、分裝與培養(yǎng) 在培養(yǎng)瓶中加入在培養(yǎng)瓶中加入2mLDMEM生長(zhǎng)液生長(zhǎng)液(如果是如果是50mL的培養(yǎng)瓶，加的培養(yǎng)瓶，加4mL生長(zhǎng)液生長(zhǎng)液)

9、，小心吸出過(guò)濾后的細(xì)胞懸液，小心吸出過(guò)濾后的細(xì)胞懸液0.25mL至培養(yǎng)瓶中（至培養(yǎng)瓶中（如果是如果是50mL的培養(yǎng)瓶，加的培養(yǎng)瓶，加0.5mL的細(xì)的細(xì)胞懸液胞懸液)，吹打均勻蓋好瓶塞。在瓶上注明組別、日，吹打均勻蓋好瓶塞。在瓶上注明組別、日期，置期，置37溫箱中培養(yǎng)溫箱中培養(yǎng)(4h后細(xì)胞即可貼壁，后細(xì)胞即可貼壁，24-36h生長(zhǎng)成單層細(xì)胞，此時(shí)可更換培養(yǎng)液，并接種生長(zhǎng)成單層細(xì)胞，此時(shí)可更換培養(yǎng)液，并接種病毒病毒)。分裝后。分裝后2-4h不可大幅度移動(dòng)培養(yǎng)瓶，以免不可大幅度移動(dòng)培養(yǎng)瓶，以免影響細(xì)胞的貼壁和生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)影響細(xì)胞的貼壁和生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)3天，培養(yǎng)期天，培養(yǎng)期間可每天觀察間可每天觀

10、察1次。次。3天后取出，洗凈培養(yǎng)瓶，放天后取出，洗凈培養(yǎng)瓶，放回實(shí)驗(yàn)室?；貙?shí)驗(yàn)室。（四）細(xì)胞形態(tài)觀察（四）細(xì)胞形態(tài)觀察 檢查時(shí)注意培養(yǎng)液的顏色變化，變黃但不混濁表檢查時(shí)注意培養(yǎng)液的顏色變化，變黃但不混濁表示有細(xì)胞生長(zhǎng)，變紅表示細(xì)胞未生長(zhǎng)或生長(zhǎng)不佳。示有細(xì)胞生長(zhǎng)，變紅表示細(xì)胞未生長(zhǎng)或生長(zhǎng)不佳。37培養(yǎng)培養(yǎng)24-48h后，于倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞可后，于倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞可以長(zhǎng)成單層，細(xì)胞透亮，呈纖維狀，細(xì)胞膜清晰。以長(zhǎng)成單層，細(xì)胞透亮，呈纖維狀，細(xì)胞膜清晰。五、注意事項(xiàng)五、注意事項(xiàng)1、整個(gè)過(guò)程嚴(yán)格無(wú)菌操作、整個(gè)過(guò)程嚴(yán)格無(wú)菌操作2、培養(yǎng)液不要太多，應(yīng)有足夠的空間保證細(xì)胞對(duì)、培養(yǎng)液不要太多，應(yīng)有足夠的空間保證細(xì)胞對(duì) 氧的需要氧的需要3、放入、放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)時(shí)，不要將蓋子擰得太培養(yǎng)箱培養(yǎng)時(shí)，不要將蓋子擰得太 緊，并將緊，并將CO2濃度控制在濃度控制在5%4、一般、一般2d換一次培養(yǎng)液，細(xì)胞長(zhǎng)成單層后要及換一次培養(yǎng)液，細(xì)胞長(zhǎng)成