細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)方案

1、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案1.準(zhǔn)備材料：DMEM高糖)胰酶雙抗(青霉素/鏈霉素)DAPIMTT(5mg/mL)DMSOPB多4%甲醛指甲油6孔培養(yǎng)板96孔培養(yǎng)板超薄載玻片培養(yǎng)瓶(25mL)一包0.45卩m濾膜滅菌：50mL 10mL 5mL離心管兩種槍頭2. 實(shí)驗(yàn)方案本實(shí)驗(yàn)所用的 材料 為載藥的通過(guò)二硫鍵橋連透明質(zhì)酸的夾心二氧化硅(SiO2-SS-HA/DOX ,在高谷胱甘肽條件下，二硫鍵斷裂，透明質(zhì)酸脫離，同時(shí) 夾心二氧化硅中藥物得以釋放。 本實(shí)驗(yàn)的 目的 為測(cè)定透明質(zhì)酸修飾的夾心二氧化 硅（SiO2-SS-HA/DOX 的細(xì)胞毒性。實(shí)驗(yàn)組為 SiO2-SS-HA/DOX SQ-SS-HA、DOX

2、SiO2-SS-HA/DOX、空白對(duì)照組為純細(xì)胞,分別采用HepG2人肝癌細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞模型和L929成纖維 細(xì)胞為正常細(xì)胞模型。采用HepG2人肝癌細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞模型，實(shí)驗(yàn)組為SiO2-SS-HA、DOX空白對(duì)照組為純細(xì)胞。培養(yǎng)基中含有10%(v/v)FBS和1%(w/v)雙抗(青霉素/鏈霉素)。配制不同濃度的SiO2-SS-HA/DOX SiO2、HA DOX藥物載體培養(yǎng)基溶液。(1).以HepG2人肝癌細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞模型：培養(yǎng)基的配置：雙抗 1%血清 12%DMEM87%具體操作步驟：細(xì)胞的復(fù)活： 將凍存于液氮中的細(xì)胞取出，迅速放入 37 r溫水中，使細(xì)胞快速溶解。 將懸浮的細(xì)胞移至離心

3、管中，加 5mL無(wú)血清培養(yǎng)基，1000rmp,5min離心 去上清，再加5mL有血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中。(每次轉(zhuǎn)移時(shí)，將之前的離 心管洗滌，并用移液槍來(lái)回吸，使液體混合均勻。 ) 將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞的傳代：將0.25%的胰酶分裝至小離心管中，每個(gè)管中2mL凍存于-20 C,每次使用 一管，避免反復(fù)凍融。 將培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出，蓋子旋緊，噴 75%勺酒精放入超凈臺(tái)。 將培養(yǎng)液倒入廢液缸， 殘留培養(yǎng)基用吸管吸干凈， 操作完成后， 培養(yǎng)瓶口 用火燒。 加入2mL胰酶將瓶底鋪滿，消化2-3min，于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，呈 圓形，即消化完畢，加入2mL12%DMEM止消化，用槍吹打，

4、使細(xì)胞懸浮。 將細(xì)胞懸浮液移入10mL離心管中，1000rmp,5min,離心。 迅速倒掉上清，加入 6mLDME培養(yǎng)基，分裝至兩個(gè)培養(yǎng)瓶中，再各加入 2mLDMEM至5mL于37C, 5%勺CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。 下一次傳代步驟同 -。細(xì)胞存活率測(cè)定方法(布板，加樣) 同傳代步驟 -。 給每個(gè)離心管中加入定量的培養(yǎng)基， 并用移液槍來(lái)回吸， 使液體混合均勻，將所有含有細(xì)胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到一個(gè) 50mL離心管中，最終使液體體積為30mL 96 孔板中每個(gè)濃度設(shè)計(jì) 5 個(gè)復(fù)孔，每塊板設(shè)一組空白調(diào)零孔，內(nèi)加培養(yǎng)液，不含細(xì)胞與藥物，一組空白對(duì)照組，只加培養(yǎng)基和細(xì)胞，不加藥物。除過(guò)空 白調(diào)零孔，每孔加入

5、100卩L含細(xì)胞的培養(yǎng)基。將孔板放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱保 持一定的濕度，5%(v/v)CO2,溫度保持在37C,培養(yǎng)22小時(shí)。 將0.03g谷胱甘肽加入到10mL培養(yǎng)基，充分溶解，濃度為0.003g/mL,取2微升的0.003g/mL谷胱甘肽溶液加入到10mL的培養(yǎng)基中，將這兩個(gè)濃度含谷胱甘肽的培養(yǎng)基替換部分原來(lái)的培養(yǎng)基， 作為對(duì)照， 不需要加谷胱甘肽的孔換上新鮮培養(yǎng)基，將孔板放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱保持一定的濕度，5%(v/v)CO2，溫度保持在37r，培養(yǎng)2小時(shí)，具體的加樣孔見(jiàn)圖一。 將1.2mg的SiO2-SS-HA/DOX羊品溶到3mL的培養(yǎng)基中，分成兩份，其中一份里加入1.5mL的培養(yǎng)基，

6、再將稀釋后的含液樣的培養(yǎng)基分成兩份，其中一份加入1.5mL新鮮培養(yǎng)基，依此類推，便得到一個(gè)濃度梯度的SiOaSS-HA/DOX樣品。 SiO2-SS-HA 樣品勺濃度配制方法同上。 將0.918mg的SQ-SS-HA/DOX羊品溶到3mL的培養(yǎng)基中，剩下的步驟同 。 將配制好的載體溶液替換原來(lái) 96孔板中的培養(yǎng)基，如圖 1 所示。將孔板 放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱保持一定的濕度，5%(v/v)CO2,溫度保持在37r，培養(yǎng)24小時(shí)。 配制5mg/mL的MTT溶液，將孔板中的培養(yǎng)更換成 MTT溶液，將孔板放入 培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱保持一定的濕度，5%(v/v)CO2，溫度保持在37r。培養(yǎng)4小時(shí) 后，將孔

7、板中的培養(yǎng)基取出，用 PBS溶液清洗3次，然后向每孔加入100卩L的DMSO溶解孔中的甲瓚，采用酶標(biāo)儀測(cè)定，波長(zhǎng)設(shè)定為 490nm(2).以L929成纖維細(xì)胞為正常細(xì)胞模型體布板示意圖實(shí)驗(yàn)組為 SiO2-SS-HA/DOX SiOSS-HA、DOX空白對(duì)照組為純細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑闇y(cè)定藥物載體溶液對(duì)正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性。培養(yǎng)基的配置：雙抗1%t清12%DMEM87%具體操作步驟:細(xì)胞的復(fù)活: 將凍存于液氮中的細(xì)胞取出，迅速放入 37 r溫水中，使細(xì)胞快速溶解。將懸浮的細(xì)胞移至離心管中，加 5mL無(wú)血清培養(yǎng)基，1000rmp,5min離心 去上清，再加5mL有血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中。(每次轉(zhuǎn)移時(shí)，

8、將之前的離 心管洗滌，并用移液槍來(lái)回吸，使液體混合均勻。) 將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞的傳代:將0.25%的胰酶分裝至小離心管中，每個(gè)管中2mL凍存于-20 C,每次使用一管，避免反復(fù)凍融。 將培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出，蓋子旋緊，噴 75%勺酒精放入超凈臺(tái)。 將培養(yǎng)液倒入廢液缸，殘留培養(yǎng)基用吸管吸干凈，操作完成后，培養(yǎng)瓶口 用火燒。加入2mL胰酶將瓶底鋪滿，消化2-3min，于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，呈 圓形，即消化完畢，加入2mL12%DMEM止消化，用槍吹打，使細(xì)胞懸浮。 將細(xì)胞懸浮液移入10mL離心管中，1000rmp,5min,離心。 迅速倒掉上清，加入 6mLDMEI培養(yǎng)基，分裝至兩個(gè)

9、培養(yǎng)瓶中，再各加入2mLDMEM至 5mL于37C, 5%勺CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。 下一次傳代步驟同-。細(xì)胞存活率測(cè)定方法(布板，加樣)同傳代步驟-。給每個(gè)離心管中加入定量的培養(yǎng)基，并用移液槍來(lái)回吸，使液體混合均勻, 將所有含有細(xì)胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到一個(gè) 50mL離心管中，最終使液體體積為12mL 96孔板中每個(gè)濃度設(shè)計(jì)5個(gè)復(fù)孔，每塊板設(shè)一組空白調(diào)零孔，內(nèi)加培養(yǎng) 液，不含細(xì)胞與藥物，一組空白對(duì)照組，只加培養(yǎng)基和細(xì)胞，不加藥物。除過(guò)空 白調(diào)零孔，每孔加入100卩L含細(xì)胞的培養(yǎng)基。將孔板放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱保 持一定的濕度，5%(v/v)CO2,溫度保持在37r，培養(yǎng)22小時(shí)。 將所有加樣的孔換成新

10、鮮培養(yǎng)基， 作為與癌細(xì)胞的對(duì)照。將孔板放入培 養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱保持一定的濕度，5%(v/v)CO2，溫度保持在37r，培養(yǎng)2小時(shí)。將0.4mg的SiO2-SS-HA/DOX羊品溶到1mL的培養(yǎng)基中，分成兩份，其中 一份里加入0.5mL的培養(yǎng)基，再將稀釋后的含液樣的培養(yǎng)基分成兩份，其中一份加入0.5mL新鮮培養(yǎng)基，依此類推，便得到一個(gè)濃度梯度的SiO2-SS-HA/DOXW品。SiO2-SS-HA樣品的濃度配制方法同上。 將0.306mg的SQ-SS-HA/DOX羊品溶到1mL的培養(yǎng)基中，剩下的步驟同 。 將配制好的載體溶液替換原來(lái) 96孔板中的培養(yǎng)基，如圖2所示。將孔板放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱保持一定的濕度，5%(v/v)CO2，溫度保持在37C，培養(yǎng)24小時(shí)。配制5mg/mL的MTT溶液，將孔板中的培養(yǎng)更換成 MTT溶液，將孔板放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱保持一定的濕度，5%(v/v)CO2，溫度保持在37C。培養(yǎng)4小時(shí) 后，將孔板中的培養(yǎng)基取出，用 PBS溶液清洗3次，然后向每孔加入100卩L的DMSO溶解孔中的甲瓚，采用酶標(biāo)儀測(cè)定，波長(zhǎng)設(shè)定為 490nm細(xì)胞存活率米用百分比表示：細(xì)胞存活率=(OD