熒光壽命成像技術(shù)FLIM

1、生物光子學(xué)大作業(yè)作業(yè)名稱：熒光壽命成像技術(shù) FLIM學(xué)號(hào)成日期：2016628熒光壽命成像技術(shù)FLIM摘要：熒光壽命顯微成像技術(shù)（FLIM ）技術(shù)是一種新穎的熒光成像技術(shù), 具有其他熒光成像技術(shù)無(wú)法代替的優(yōu)異性能， 是生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。頻域調(diào)制、門(mén)控探測(cè)和時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)是FLIM的幾種主要實(shí)現(xiàn)方法。綜述了這些計(jì)數(shù)的原理、研究現(xiàn)狀和已取得的部分成果， 比較了這三種方法的時(shí) 間分辨率和成像速度等參數(shù)的優(yōu)劣。寬場(chǎng)FLIM更適用于延時(shí)成像和實(shí)時(shí)成像。熒光偏振各向異性成像和內(nèi)窺鏡FLIM技術(shù)都是FLIM技術(shù)很有前景的應(yīng)用方向。Fluoresce neeLifeti

2、meImag ingMieroseo py(FLIM)Why lifetime Imaging?The fluorescencefluorescent materiallifetime is the signature of a;It is the exponentialdecay in emission after the excitation of a fluorescent material has been stopped. FLIM is a technique to map the spatial distribution of lifetimes within microscop

3、ic images and it allows measurements in living cells as well as in fixed.Because of the fact that some p henomena do affect fluorescence lifetimes, the lifetime is used to detect these phenomena leading to various applications such as; lon imaging ,oxygen imaging, p robing microenvironment, and medi

4、cal dlagnosis.Frequency domain methodThe homodyne frequency domain FLIM method requires a modulated light source and a modulated detector.In the LIFE system these are the LED and the intensified CCD camere. Both are modulated at exactly the same frequency,but with an adjustable diffrence in p hase.T

5、hese two p arameters dep end onthe fluorescence lifetime of the sampieand the modulation frequency and are measured to calculate the flurescence lifetime in each pi xel of the image.1、基本概念熒光是分子吸收能量后使得其基態(tài)電子被激發(fā)到單線激發(fā)態(tài)后由第一單 線激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)所發(fā)生的輻射復(fù)合發(fā)出的光。熒光壽命是指分子受到光脈沖激發(fā)后返回基態(tài)之前在激發(fā)平均停留的時(shí)間，處于激發(fā)態(tài)的熒光分子在從激發(fā)到基態(tài)的過(guò)程中發(fā)射熒光

6、釋放能量。熒光 壽命是熒光物質(zhì)固有性質(zhì)，與濃度，光漂白和激發(fā)強(qiáng)度無(wú)關(guān)，依賴于圍繞熒光 物質(zhì)的離子和局部環(huán)境，比如蛋白質(zhì)的束縛等。影響熒光壽命的因素：熒光物 質(zhì)的結(jié)構(gòu)；所處微環(huán)境的極性、溫度、粘度，鍵合離子等條件有關(guān)。熒光壽命成像可以區(qū)分熒光物質(zhì)濃度和淬滅效應(yīng)的影響，這使得熒光壽命成像顯微學(xué)成 為一個(gè)有力的工具進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)的定量環(huán)境和分子動(dòng)力學(xué)分析。熒光壽命成像技術(shù)有兩種：時(shí)間域和頻率域。(1)時(shí)域FLIM :需要脈沖光源，所以一般在雙光子的系統(tǒng)上比較常見(jiàn)，因?yàn)榧す馐敲}沖的而且買(mǎi)雙光子的老師一般也搭配一個(gè)FLIM。光路調(diào)節(jié)也是一個(gè)問(wèn)題，提供的廠家一般是 Becker&HickI和PicoQ

7、uant德國(guó)公司。這個(gè)方法比較流行，也有很多系統(tǒng)。(2 )頻域FLIM :需要一個(gè)相位調(diào)制的光源，有用LED調(diào)制的，荷蘭的2、FLIM技術(shù)的分類及總體進(jìn)展熒光發(fā)射后會(huì)以指數(shù)規(guī)律衰減。熒光壽命通常定義為熒光強(qiáng)度降至最大值 的1/e時(shí)所需要的時(shí)間，常用T表示。由于熒光分子所處環(huán)境的不同，熒光發(fā) 射可分為單組分和多組分兩類， 最簡(jiǎn)單的情況即單組分下，熒光信號(hào)衰減可表示為IIoex)( t/ )如果有大量處在相似環(huán)境里的熒光分子被激發(fā)，那么發(fā)射熒光的衰減遵循單指數(shù)規(guī)律。典型的熒光信號(hào)通常都是多組分，即多指數(shù) 衰減規(guī)律。FLIM技術(shù)發(fā)展到現(xiàn)在，形成了頻域和時(shí)域兩大類方法。其中門(mén)控探測(cè)、時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)

8、和掃描相機(jī)成像是三種主要的時(shí)域?qū)崿F(xiàn)方法。國(guó)際上從20世紀(jì)80年代開(kāi)始熒光壽命成像發(fā)面的研究工作。較早從事熒光壽命成像技術(shù)方面的研究工作是日本大阪大學(xué)，他們提出的頻率調(diào)制法來(lái) 進(jìn)行熒光壽命的測(cè)量。頻率調(diào)制法原理清晰，設(shè)備要求低，系統(tǒng)簡(jiǎn)單而且造價(jià) 低，技術(shù)也日趨成熟。睡者生物醫(yī)學(xué)測(cè)量的需要，可進(jìn)行納秒、皮秒量級(jí)熒光 壽命成像的實(shí)時(shí)時(shí)域FLIM技術(shù)隨后興起，具有成像速度快，時(shí)間分辨率高等優(yōu)點(diǎn)。TCSPC是一種經(jīng)典的光子測(cè)量技術(shù)，在目前時(shí)域FLIM中應(yīng)用最廣泛,技術(shù)也很成熟。與此同時(shí)，時(shí)間分辨率不及TCS PC,但成像速度更快的門(mén)控FLIM技術(shù)逐漸成為FLIM領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。3、條紋相機(jī)方法測(cè)量熒光壽

9、命I E 5 y;4A 11 -trigger signalnIncidentSi'eep； eg voltage工作原理：條紋相機(jī)把熒光中的時(shí)間信息轉(zhuǎn)化為空間信息的裝置。典型的條紋 相機(jī)由條紋管、快速掃描電極、輸入和輸出裝置。條紋相機(jī)主要是用來(lái)測(cè)量超 快熒光。由超短光脈沖誘導(dǎo)的、從樣品發(fā)出的熒光被聚焦在條紋相機(jī)的光陰電 極上，從光陰電極上釋放的光電子流量與聚焦在光陰電極上的熒光強(qiáng)度成比, 這些電子在加速電場(chǎng)中被加速， 然后在偏轉(zhuǎn)電場(chǎng)中被偏離，最后入射到熒光屏 的磷光粉上。因此，在不同的時(shí)刻，從光陰電極上釋放出來(lái)的光電子入射到熒 光屏上位置也不同。這樣在熒光屏上就可以看到一條條軌跡或者

10、稱之為條紋, 這些條紋的空間分辨率直接對(duì)應(yīng)于熒光的時(shí)間分辨率。 類型細(xì)分為飛秒條紋相機(jī)，大動(dòng)態(tài)范圍條紋相機(jī)，幀條紋相機(jī)，X-射線條紋相機(jī)等。4、頻域FLIM技術(shù)頻域FLIM使用正選調(diào)制的激光器或者發(fā)光二極管LED作為光源對(duì)樣品進(jìn)行激發(fā)，樣品會(huì)產(chǎn)生與激發(fā)光同頻率但相位差為？ ©的熒光信號(hào)然后使用同頻率調(diào) 制的CCD或者PMT作為探測(cè)器解調(diào)并接收熒光信號(hào)，通過(guò)測(cè)量解調(diào)系數(shù)M， 即可計(jì)算相應(yīng)的熒光壽命T和T。c M1T=tan coaca a B牟DCM=ACem/DC emAC ex/AC ex(t)國(guó)際上對(duì)頻域FLIM的研究開(kāi)展較早。如何提高成像速率成為頻域FLIM技術(shù)首先需要解決的問(wèn)

11、題。1999年，瑞士環(huán)境工程研究所 Mizeret等實(shí)現(xiàn)了視頻速率的內(nèi)窺鏡頻域 FLIM成像，將其應(yīng)用到了醫(yī)療診斷領(lǐng)域，2000年,伊利洛伊大學(xué)厄本那分校 Holub等實(shí)現(xiàn)了幀頻55Hz的頻域，是當(dāng)時(shí)最快幀頻。2004 年,新加坡南洋理工大學(xué)Seah等使用頻域FLIM完成了對(duì)潛在指紋的識(shí)別。5、時(shí)域FLIM技術(shù)時(shí)域FLIM通過(guò)脈沖激光器激發(fā)熒光團(tuán)，利用探測(cè)器等直接探測(cè)熒光衰減信號(hào)成像。時(shí)域設(shè)備與頻域相比，通常有更快的成像速度和更高的時(shí)間分辨率，因此對(duì)設(shè)備要求更高。TCSPC有理想的光子計(jì)數(shù)率和超高的時(shí)間分辨率，與門(mén)控探測(cè)相比，可測(cè)量更短的熒光壽命。門(mén)控法的熒光壽命分辨率雖不及TCSPC,但圖像

12、獲取速度通常很快，是實(shí)現(xiàn)非穩(wěn)態(tài)過(guò)程探測(cè)的有力技術(shù)手段。5.1時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)某一段時(shí)間內(nèi)檢測(cè)到發(fā)射光子的概率與此時(shí)段內(nèi)的熒光強(qiáng)度成正比,通過(guò)測(cè)量探測(cè)熒光強(qiáng)度的衰減即可實(shí)I II現(xiàn)熒光壽命的探測(cè)。TCS PC基于上述原理實(shí)現(xiàn)，構(gòu)造出如右圖熒光發(fā)射光子在時(shí)間軸上的概率分布曲線，即熒光衰減曲線。由于每個(gè)周期只記錄圖2單光子計(jì)數(shù)帛理Fig.2 PhnciplEsof TCSPC5.2門(mén)控探測(cè)左圖為理想的單指數(shù)熒光衰減曲線，在激發(fā)光E(t)作用下，熒光團(tuán)發(fā)射熒光，熒光強(qiáng)度F(t)與時(shí)間t關(guān)系可表示為F(t)=Foexp(-t/ T，熒光壽命可通過(guò)在兩個(gè)不同時(shí)刻開(kāi)啟的相同寬度的門(mén)內(nèi)記錄的熒光強(qiáng)度信息求得

13、。在條件允許 下，通常采用多門(mén)探測(cè)。一個(gè)典型的設(shè)置為：取三個(gè)不同的延遲時(shí)刻，每個(gè)門(mén)記錄15幅圖像1(1J i1A重|'111 II右圖是個(gè)典型的門(mén)控?zé)晒鈮勖上裣到y(tǒng)簡(jiǎn)圖。 通常由激發(fā)光源、光電探測(cè) 器、延遲裝置及圖像處理設(shè)備組成門(mén)控裝置的光源通常為短脈寬超快激光器, 以提高生物樣品成像的壽命分辨率。CCD是常見(jiàn)的成像設(shè)備，CCD門(mén)寬對(duì)成 像精度的影響還需要深入研究。延遲裝置提供 FLIM的控制信號(hào)。熒光強(qiáng)度圖像生成壽命圖像的方法有兩種:RLD 和 WNLLS 。6、寬場(chǎng)FLIM系統(tǒng)寬場(chǎng)FLIM是寬視場(chǎng)的熒光壽命成像顯微鏡，右圖給出了寬場(chǎng)顯微鏡與掃描顯微鏡的對(duì)比。，寬場(chǎng)FLIM優(yōu)勢(shì)在于較

14、弱的熒光團(tuán)光漂白效應(yīng)和較快的系統(tǒng)成像速I(mǎi)山"I-Ih Ih ««-iij rI ' J# JTT" T門(mén)7弓I pJ H. d.r -I, - “I "I I Fr.'i 1 I* LT rI -II*11- +'41- tj.trII- *度，相同探測(cè)率下，所需要的激發(fā)光要小的多，則樣品受到光漂白的影響會(huì)小于掃創(chuàng)凱光掃描英光皿撤規(guī)瑾場(chǎng)熒比妊徴悅Fig-5tawT （canniTif 砧描系統(tǒng)。寬場(chǎng)系統(tǒng)缺點(diǎn)在于其成像深度小與掃描系統(tǒng)，無(wú)法得到樣本深層的圖像，可通過(guò)其他手段得到改善。7、FLIM技術(shù)與癌癥診斷癌細(xì)胞的自熒光

15、特性與正常組織有較大差異，同時(shí)也可用于區(qū)分癌細(xì)胞的不同生長(zhǎng)周期。其自熒光特性之一的熒光壽命提供了癌癥診斷的新依據(jù)。近年來(lái)，國(guó)際FLIM研究熱點(diǎn)紛紛集中在FLIM對(duì)癌癥的輔助診斷上，研究方向逐漸由體外病理檢驗(yàn)向體內(nèi)診斷治療發(fā)展。內(nèi)窺鏡是臨床診療，特別是胃癌、食道癌診斷中非常重要的手段。因此FLIM與內(nèi)窺鏡的結(jié)合，將極大發(fā)揮其對(duì)癌癥組織的精確定位的優(yōu)勢(shì)。實(shí)時(shí)成像在內(nèi)窺鏡診斷中是非常有必要的。8、FLIM技術(shù)的應(yīng)用1）細(xì)胞體自身熒光壽命分析2）自身熒光相對(duì)熒光標(biāo)記的有效區(qū)分3）具有相同頻譜性質(zhì)的不同熒光標(biāo)記的區(qū)分4）活細(xì)胞內(nèi)水介質(zhì)的PH值測(cè)量5）局部氧氣濃度測(cè)量 6）活細(xì)胞內(nèi)鈣濃度測(cè)量 7）時(shí)間分辨

16、Forster共振能量轉(zhuǎn)移（Fret）:納米級(jí)尺度上的遠(yuǎn)程測(cè)量，環(huán)境敏感的FRET探針定量測(cè)量。總結(jié)：在各種FLIM方法中，TCSPC的時(shí)間分辨率最高，文獻(xiàn)報(bào)道可達(dá)25ps，門(mén)控FLIM僅此于TCSPC,可進(jìn)行納秒量級(jí)的壽命測(cè)試。 但在成像速度上，門(mén) 控FLIM是最快的，文獻(xiàn)報(bào)道幀頻可達(dá)100Hz。頻域FLIM的成本最低，應(yīng)用最廣泛，但其性能指標(biāo)均不及TCSPC和門(mén)控FLIM為主的時(shí)域方法。寬場(chǎng)FLIM可實(shí)現(xiàn)更快的幀頻，更適合應(yīng)用門(mén)控FLIM。內(nèi)窺鏡FLIM有廣闊的醫(yī)療應(yīng)用前景，可用于癌癥等疾病的早期診斷。參考文獻(xiàn):1、Li Dongxu , Xu Xiao , Li Na et al. Ti

17、me resoluti on fluoresce neetech no logyand fluoresce nee lifetime measureme ntJ.U niversityChemistry, 2008, 23:211李東旭，徐瀟，李娜等.時(shí)間分辨熒光技術(shù)與熒光壽命測(cè)量J.大學(xué)化學(xué)，2008，23:211 2、陳同生，王巖等.利用基于掃描相機(jī)的熒光壽命成像顯微技術(shù)研究細(xì)胞周期J.中國(guó)激光，2011,38(3) :304002 3、Y. Sun，N. Hatami , M.Yee et al. Fluoresce nee lifetime imag ingmierose opyfor

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