第6課時土壤中尿素細菌的分離與計數

1、第6課時土壤中分解尿素細菌的分離與計數目標導航1.研究培養(yǎng)基對微生物的選擇作用。2.進行微生物數量的測定。一、研究思路 1篩選菌株(1)實驗室中微生物篩選的原理人為提供有利于_生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時_或_其他微生物生長。(2)選擇培養(yǎng)基在微生物學中，將允許_種類的微生物生長，同時_或_其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱做選擇培養(yǎng)基。(3)分離分解尿素的細菌的選擇培養(yǎng)基在該培養(yǎng)基配方中，為微生物的生長提供碳源的是_，提供氮源的是_，瓊脂的作用是凝固劑。該培養(yǎng)基對微生物具有選擇作用。其選擇機制是_才能在該培養(yǎng)基上生長。土壤中的細菌之所以能分解尿素，是因為它們體內能合成_，將尿素分解

2、的反應式是_。Taq細菌能忍受93左右的高溫，是在美國黃石國家公園的一個熱泉中發(fā)現的，這說明，在尋找目的菌株時，要根據_。2統(tǒng)計菌落數目的方法(1)稀釋涂布平板法(也叫活菌計數法)原理：當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的_，通過統(tǒng)計平板上的_，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。操作第一，設置重復組，增強實驗的說服力與準確性。將待測樣品經一系列10倍稀釋，然后選擇_稀釋度的菌液，分別取0.1 mL接種到已制備好的平板上，然后用無菌涂布器將菌液涂布整個平板表面，放在適宜的溫度下培養(yǎng)并計算菌落數。為使結果接近真實值，可將同一稀釋度涂布到三個或三個以上的平板上，培養(yǎng)

3、并計算出_。第二，為了保證結果準確，一般選擇菌落數在_的平板進行計數，若設置的重復組中結果相差太遠，意味著操作有誤，需重新實驗。計算公式：每克樣品中的菌株數×M，其中C代表_，V代表_(mL)，M代表_。(2)顯微鏡直接計數法原理：此法利用特定的_或_，在顯微鏡下計算一定容積的樣品中微生物的數量，但不能區(qū)分細菌的死活。計數板是一塊特制的載玻片，上面有一個特定的面積1 mm2和高0.1 mm的計數室，在1 mm2的面積里又被劃分成25個(或16個)中格，每個中格進一步劃分成16個(或25個)小格，計數室由_個小格組成。操作：將稀釋的樣品滴在計數板上，蓋上蓋玻片，然后在顯微鏡下計數45個

4、中格中的細菌數，并求出每個小格所含細菌的平均數，再按公式求出每毫升樣品中所含的細菌數。計數公式：每毫升原液所含細菌數每小格平均細菌數×400×10 000×稀釋倍數。(3)設置重復和對照設置重復：培養(yǎng)過程中應設置重復組，同一稀釋度下應涂布_個平板，才能增強實驗的說服力與準確性。設置對照：實驗中應設置對照，主要目的是_對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度。如_對照組，觀察培養(yǎng)物中是否有雜菌污染；設置_培養(yǎng)基，觀察選擇培養(yǎng)基是否具有_作用。二、實驗設計實驗步驟1土壤取樣：從肥沃、濕潤的土壤中，用無菌小鐵鏟鏟去表層土3 cm左右，迅速取土壤并裝入_密封或事先準備好的_

5、中。2制備培養(yǎng)基：制備_培養(yǎng)基作為對照組，尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基作為_，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否具有_。放寬稀釋范圍，如稀釋倍數為103107范圍內的要分別涂布，而每個稀釋度下需要_個選擇培養(yǎng)基、_個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，因此需要15個選擇培養(yǎng)基和5個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。兩種培養(yǎng)基應各有一個作為_對照，此外還需準備8個滅菌的試管和1個滅菌的移液管。3樣品的稀釋與涂布平板：參考下面的實驗流程示意圖，將10 g土樣加入盛有90 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中(錐形瓶體積為250 mL)，充分搖勻，吸取上清液1 mL，轉移至盛有_ mL生理鹽水的無菌大試管依次等比稀釋至107稀釋度，并按照由107103稀釋

6、度的順序分別吸取_mL進行平板涂布操作。按照濃度從低到高的順序涂布平板，不必更換移液管。說明：圖中的1、2、3平板是_，4為_作對照，判斷選擇培養(yǎng)基是否具篩選作用，還有兩個空白對照，即不涂布稀釋后菌液的選擇培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，驗證培養(yǎng)基中是否_。4將涂布好的培養(yǎng)皿放在30溫度下培養(yǎng)，及時觀察和記錄。5挑選選擇培養(yǎng)基上不同形態(tài)的菌落接入含_培養(yǎng)基的斜面中，觀察能否產生顏色反應。6細菌的計數當菌落數目穩(wěn)定時，選取菌落數在_的平板進行計數。在同一稀釋度下，至少對3個平板進行重復計數，然后求出_，并根據平板所對應的稀釋度計算出樣品中細菌的數目。同時仔細觀察所分離到的菌落，并記錄菌落特征。7統(tǒng)計

7、表格表一平板上的菌落數記錄表稀釋倍數10310410510610712341234123412341234123表二菌落特征記錄表 菌落種類形狀大小隆起程度顏色123注：一般來說，在一定的培養(yǎng)條件下(相同的培養(yǎng)基、溫度及培養(yǎng)時間)，_表現出_的菌落特征。三、操作提示1取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的信封在使用前都要_。2應在_旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入_中，塞好棉塞。3在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在_旁操作。4實驗時要對_做好標記。注明_等。5為了提高效率，在操作時更加有條不紊，應當_。四、結果分析與評價內容結論分析有無雜菌污染的判斷對照的培養(yǎng)皿中_菌落生長未被雜菌污染培養(yǎng)物中菌落

8、數_被雜菌污染菌落形態(tài)多樣，菌落數偏高培養(yǎng)物中混入_選擇培養(yǎng)基的篩選作用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的菌落數目_選擇培養(yǎng)基的數目選擇培養(yǎng)基具篩選作用，已篩選出一些菌落樣品的稀釋操作得到2個或2個以上菌落數目在_的平板操作成功，能進行菌落的計數重復組的結果若選取同一種土樣，統(tǒng)計結果應_；如果結果相差太遠，說明實驗操作過程中出現操作失誤，需要找出產生差異的原因五、課題延伸在細菌分解尿素的化學反應中，細菌合成的_將尿素分解成了_。氨會使培養(yǎng)基的堿性增強，_升高。因此，我們可以通過檢測培養(yǎng)基_來判斷該化學反應是否發(fā)生。在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入_指示劑，培養(yǎng)某種細菌后，如果pH升高，指示劑將_，這樣，我們

9、就可以準確地鑒定該種細菌能夠分解尿素。知識點一研究思路1下表為本課題使用的培養(yǎng)基，分析培養(yǎng)基配方，回答下面的問題。KH2PO41.4 gNa2HPO42.1 gMgSO4·7H2O0.2 g葡萄糖10.0 g尿素1.0 g瓊脂15.0 g用蒸餾水定容到1 000 mL(1)在該培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別是_。(2)按物理性質劃分該培養(yǎng)基屬于_培養(yǎng)基，理由是培養(yǎng)基中含有_；該類培養(yǎng)基常用于微生物的_等。(3)由于_，所以該培養(yǎng)基只能用于能夠合成_的微生物的培養(yǎng)。用此培養(yǎng)基培養(yǎng)土壤浸出液能夠從土壤中篩選出_的細菌。(4)在微生物學中，將_的培養(yǎng)基，稱作選擇培養(yǎng)基。

10、2廣東省是我國甘蔗生產區(qū)之一。甘蔗是一種高光效的C4植物，單位面積產量很高，種植面積日益擴大，目前已成為南方地區(qū)燃料酒精生產的重要原料。利用甘蔗生產燃料酒精的一般工藝流程為：甘蔗榨汁(蔗糖)酵母發(fā)酵蒸餾成品(燃料酒精)。(1)具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精發(fā)酵菌種，對野生酵母菌進行誘變后通過篩選可以得到具有這些特性的突變菌，誘變及篩選過程如下：步驟1：野生菌液體培養(yǎng)一段時間后接受紫外線照射誘變處理。步驟2：制備選擇培養(yǎng)基。在基本培養(yǎng)基的基礎上，注意_和_，加瓊脂后滅菌，制成固體平板。步驟3：將紫外線照射后的菌液稀釋涂布平板。步驟4：根據_，篩選出突變菌。(2)上述步驟2、3和4的依據

11、分別是_。知識點二實驗設計3用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數，在對應稀釋倍數為106的培養(yǎng)基中，得到以下幾種統(tǒng)計結果，正確的是()A涂布了1個平板，統(tǒng)計的菌落數是230B涂布了2個平板，統(tǒng)計的菌落數是215和260，取平均值238C涂布了3個平板，統(tǒng)計的菌落數分別是21、212和256，取平均值163D涂布了3個平板，統(tǒng)計的菌落數分別是210、240和250，取平均值2334在本實驗操作中對使用的平板和試管要進行標記，以下說法正確的是()A對培養(yǎng)皿僅需注明培養(yǎng)基的種類即可B一般在使用之后進行標記C由于試管用的較多，只需對試管進行標記即可D標記的目的主要是為了防止實驗中平板、試管等的混

12、淆一、選擇題1在缺乏氮源的培養(yǎng)基上，大部分微生物無法生長；在培養(yǎng)基中加入青霉素可以抑制細菌和放線菌的生長；在培養(yǎng)基中加入10%的酚可以抑制細菌和霉菌的生長。利用上述選擇培養(yǎng)基依次能從混雜的微生物群體中分離出()A乳酸菌、金黃色葡萄球菌、放線菌B固氮細菌、大腸桿菌、放線菌C固氮細菌、霉菌、放線菌D固氮細菌、金黃色葡萄球菌、放線菌2請選出下列正確的操作步驟()土壤取樣稱取10 g土壤，取出加入盛有90 mL無菌水的錐形瓶中吸取0.1 mL土壤溶液進行平板涂布依次稀釋至101、102、103、104、105、106、107稀釋度ABCD3在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑的目的是()A篩選出

13、能分解尿素的細菌B對分離的菌種作進一步鑒定C作細菌的營養(yǎng)成分D如指示劑變藍就能準確地認定該菌能分解尿素4下面對“從土壤中分離分解尿素的細菌過程中滅菌”的理解，不正確的是()A防止雜菌污染B消滅全部微生物C稀釋土壤溶液的過程中必須在火焰旁操作D滅菌必須在接種前進行5下列不屬于菌種記數方法的是()A平板劃線法 B稀釋涂布平板法C顯微鏡檢法 D濾膜法6下列有關配制培養(yǎng)基的敘述中，正確的是()A制作固體培養(yǎng)基必須加入瓊脂B加入青霉素可得到乳酸菌C培養(yǎng)自生固氮菌不需要氮源D發(fā)酵工程一般用固體培養(yǎng)基7用稀釋涂布平板法來統(tǒng)計樣品中活菌的數目。在某稀釋濃度下某同學做了若干個平板并統(tǒng)計每個平板的菌落數，最接近樣

14、品中菌體數真實值的是()A菌落數最多的平板B菌落數量最少的平板C菌落數量適中的平板D取若干個平板菌落數量的平均值8土壤中分解尿素的微生物所需氮源為()A硝酸 B氨 C尿素 D蛋白胨二、簡答題9在現代農業(yè)中，常在飼料中加入一定量的尿素去飼養(yǎng)牛等牲畜。因其有特殊的器官瘤胃，在瘤胃中生活著多種微生物，其中許多微生物以尿素作唯一氮源。某一同學設計了如下實驗，對能分解尿素的細菌進行分離和計數。.取樣：到屠宰場，在剛宰殺的牛的瘤胃中取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中密封。.制備培養(yǎng)基：制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基。將菌液稀釋相同的倍數，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌落數應明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數目。

15、由于初次實驗，選擇了一個較寬的稀釋范圍，并且每個稀釋度下需要3個選擇培養(yǎng)基，1個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。.微生物的培養(yǎng)與觀察：按稀釋度的順序分別吸取0.1 mL進行平板涂布操作。將涂布好的培養(yǎng)皿放在30下培養(yǎng)，并且需要無氧條件。比較兩種培養(yǎng)基中菌落的數量、形態(tài)等，并做好記錄。挑選選擇培養(yǎng)基中不同形態(tài)的菌落接入含酚紅指示劑的培養(yǎng)基中，觀察是否產生顏色反應。.細菌的計數：當菌落數目穩(wěn)定時，選取平板計數。請回答下列問題：(1)制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的目的是什么？_。(2)為什么每個稀釋度下需要3個選擇培養(yǎng)基？_。(3)上述培養(yǎng)時，為什么需要無氧條件？_。(4)應用含酚紅指示劑的培養(yǎng)基的目的是什么？結果會

16、呈現出什么樣的顏色反應？原理是什么？_。(5)計數時應選什么樣的平板進行計數？怎樣計算出樣品中的細菌數目？_。10有人送來一支芽孢桿菌菌種，其中一部分芽孢桿菌有抗青霉素的能力，另一部分沒有抗性。請你把對青霉素有抗性的芽孢桿菌分離出來。(1)現有條件：無菌牛肉膏培養(yǎng)基兩個、無菌接種臺、接種工具齊備、醫(yī)用青霉素兩支。(2)實驗過程取兩個培養(yǎng)基，分別標號為A、B，向A、B兩個培養(yǎng)基中分別加入_，加入過程一定要進行_操作。向A培養(yǎng)基中接種_。接種后，將A培養(yǎng)基放入恒溫箱培養(yǎng)兩天。從_中挑取生長良好的芽孢桿菌，接種到B培養(yǎng)基中。接種后，將B培養(yǎng)基放入恒溫箱內培養(yǎng)兩天，即可獲得較多抗青霉素芽孢桿菌。第兩個

17、步驟的目的是_。第6課時土壤中分解尿素細菌的分離與計數知識清單一、1.(1)目的菌株抑制阻止(2)特定抑制阻止(3)葡萄糖尿素只有能夠以尿素作為氮源的微生物脲酶CO(NH2)2H2OCO22NH3它對生存環(huán)境的要求，到相應的環(huán)境中去尋找2(1)一個活菌菌落數三個菌落平均數30300某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數涂布平板時所用的稀釋液的體積稀釋倍數(2)細菌計數板血細胞計數板400(3)至少3排除實驗組中非測試因素空白完全篩選二、1.(1)無菌信封燒杯(2)牛肉膏蛋白胨實驗組選擇作用31空白(3)90.1選擇培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基含有雜菌(5)酚紅指示劑(6)30300平均值(7)同種微生

18、物穩(wěn)定三、1.滅菌2.火焰錐形瓶3.火焰4.培養(yǎng)皿培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物5.事先規(guī)劃時間四、無偏高其他氮源大于30300接近五、脲酶氨pHpH的變化酚紅變紅對點訓練1(1)葡萄糖和尿素(2)固體瓊脂純化、分離、計數(3)培養(yǎng)基中只有尿素一種氮源脲酶分解尿素(4)允許特定種類的微生物生長，并能抑制或阻止其他種類微生物生長解析根據培養(yǎng)基的成分，可以推斷培養(yǎng)基的類型以及適于培養(yǎng)的微生物的代謝類型。含有瓊脂、明膠等凝固劑的培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基；不含凝固劑的為液體培養(yǎng)基。不含碳源的培養(yǎng)基適于自養(yǎng)微生物的培養(yǎng)，不含氮源的培養(yǎng)基適于固氮微生物的培養(yǎng)等。固體培養(yǎng)基常用于菌種的純化、分離、記數等；液

19、體培養(yǎng)基常用于菌種的擴大培養(yǎng)和工業(yè)生產。規(guī)律鏈接(1)培養(yǎng)基主要給培養(yǎng)物提供主要的營養(yǎng)物質，另外還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質及氧氣等的要求，所以根據培養(yǎng)基成分可以推斷培養(yǎng)基的類型以及適于培養(yǎng)的微生物代謝類型。(2)選擇培養(yǎng)基是指允許特定微生物生長并抑制其他雜菌生長的培養(yǎng)基，所以配制選擇培養(yǎng)基時要明確要篩選的微生物的營養(yǎng)特點和代謝特點。2(1)添加高濃度蔗糖(葡萄糖)調低pH是否能在選擇培養(yǎng)基上生長(2)提供高糖和酸性的篩選環(huán)境；獲得單菌落；能生長的菌落具有耐高糖和耐酸的特性解析(1)要篩選耐高糖和耐酸的菌種，培養(yǎng)基中必須加入高濃度蔗糖和調低pH，能在選擇培養(yǎng)基上生長的即為所需菌種。

20、(2)步驟2是給其提供高糖或酸性的篩選環(huán)境；步驟3是為了獲得單菌落；步驟4是根據能生長的菌株具有耐高糖和耐酸的特性篩選出突變菌。3D在設計實驗時，一定要涂布至少3個平板，作為重復組，才能增強實驗的說服力與準確性，所以A、B兩項不正確。C項雖涂布了3個平板，但是，其中1個平板的計數結果與另兩個相差太遠，說明在操作過程中可能出現了錯誤，因此，不能簡單地用3個平板的計數值求平均值。規(guī)律鏈接設計實驗要遵守單一變量原則和對照原則，同時為避免結果的偶然性，使結論更有說服力和準確性，要設置重復組，重復組之間結果相差不大時直接求其平均值；若相差太大，說明操作有誤，不能簡單求平均值。4D為避免混淆，最好在使用前

21、就做好標記，對培養(yǎng)皿標記時應注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期以及平板上培養(yǎng)樣品的稀釋度等，故A、B錯。C項試管不僅需進行標記，在梯度稀釋時，還應按一定順序依次放在試管架上。達標測試1C固氮細菌可以在無氮培養(yǎng)基上生長；青霉素可以抑制細菌和放線菌的生長，但不會抑制霉菌的生長；加入10%的酚的培養(yǎng)基可以抑制細菌和青霉菌的生長，但不會抑制放線菌的生長。2C3B篩選出能分解尿素的細菌用選擇性培養(yǎng)基即可，不需要加指示劑。加入指示劑的培養(yǎng)基，目的都是對要分離的菌種作進一步的鑒定。4B5A平板劃線法可以用于菌種的純化和分離，不能用于菌種記數。6C制作固體培養(yǎng)基也可以用明膠、海藻酸鈉等；青霉素抑制細菌和放線菌的繁殖，乳酸菌屬于細菌；發(fā)酵工程一般用液體培養(yǎng)基；自生固氮菌能夠利用空氣中的氮氣作為氮源。7D用稀釋涂布平板法對樣品中活菌數目進行統(tǒng)計，只是一種估測，根據此方法的實驗過程可知，在某一稀釋度下涂布的平板菌體數具有一定的偶然性，并不是絕對均勻，所以取若干個平板菌落數量的平均值比較接近樣品中菌體數的真實值。8C只有能合成