下頜骨髁突軟骨細(xì)胞傳代過程中生物學(xué)特性變化

1、    下頜骨髁突軟骨細(xì)胞傳代過程中生物學(xué)特性變化        摘要目的:觀察體外培養(yǎng)及傳代對人髁突軟骨細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。方法:采用體外細(xì)胞培養(yǎng)、免疫生化及分子生物學(xué)方法觀察傳代過程中人髁突軟骨細(xì)胞形態(tài)、型膠原及蛋白多糖合成及、型前膠原的mRNA水平變化。結(jié)果:傳代過程中人髁突軟骨細(xì)胞型膠原合成及其mRNA水平逐漸降低，至第7代已基本喪失。而、型膠原的mRNA水平隨傳代逐漸升高，同時伴有細(xì)胞蛋白多糖合成的減少，細(xì)胞壁形態(tài)由圓形或多角形轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形占優(yōu)勢。結(jié)論:體外培養(yǎng)及

2、反復(fù)傳代可影響軟骨細(xì)胞的表型特征。髁突軟骨細(xì)胞的反分化標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)從膠原、蛋白多糖合成及細(xì)胞形態(tài)等方面綜合評價。 關(guān)鍵詞髁狀突軟骨細(xì)胞培養(yǎng)表型Phenotypic Changes of Mandibular Condylar Cartilage Cells During SubcultureJiao Yantao, Wang Dazhang, Han Wenli, et alCollege of Stomatology, West China University of Medical SciencesAbstractObjective:To demonstrate the phenotypic c

3、hanges of mandibular condylar cartilage（MCC） cells during subculture in vitro. Methods: MCC cells were harvested from human fetus by digestion of collagenase and cultured in DMEM supplemented with 10 newborn calf serum, then they were passaged when reached confluence.Morphological changes were obser

4、ved under phase-contrast microscope. Type collagen, proteoglycan synthesis and type , and procollagen mRNA levels were also studied in serial monolayer cultures. Results: During subculture，type collagen and proteoglycan synthesis were decreased, being accompanied by a lower type collagen mRNA level.

5、 In contrast, type and procollagen mRNA levels were elevated progressively. The morphology of polygonal-shaped chondrocytes was lost to the bipolar fibroblastic cells. Conclusion: Passage and culture can affect the phenotypic property of MCC cells.Key words:mandibular condylecartilagecell culture ph

6、enotype軟骨細(xì)胞的分化狀態(tài)直接影響著軟骨的生物學(xué)性能，軟骨細(xì)胞分化異常是常見關(guān)節(jié)疾患骨關(guān)節(jié)病的一個重要表現(xiàn)。研究體外環(huán)境中細(xì)胞分化狀態(tài)的變化，可為尋找骨關(guān)節(jié)病有效防治手段及建立性狀穩(wěn)定的軟骨細(xì)胞庫奠定基礎(chǔ)。以往研究1多為大關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。本研究采用形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)及分子生物學(xué)方法對體外培養(yǎng)人髁突軟骨細(xì)胞在傳代過程中的生物學(xué)行為變化進(jìn)行了觀察。1材料和方法1.1材料和試劑型膠原酶(Sigma,USA),DMEM培養(yǎng)基(Gibco，USA),小牛血清(華西醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室),型膠原單克隆抗體(Oncogene Research Products，USA)，含、型膠原cDNA片段質(zhì)粒(北

7、京醫(yī)科大學(xué)運(yùn)動醫(yī)學(xué)研究所曲綿域教授惠贈),含型膠原及-Actin cDNA片段的質(zhì)粒(華西醫(yī)科大學(xué)章錦才教授惠贈),細(xì)胞總RNA分離純化試劑盒及低熔點(diǎn)瓊脂糖（Gene Co Ltd，USA），限制性內(nèi)切酶EcoR I，Hind （Gibco，USA），地高辛標(biāo)記檢測試劑盒及尼龍膜（Boehringer Mannheim，Germany），其它試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2髁突軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、傳代參照文獻(xiàn)2方法，下頜骨髁突軟骨取自因健康原因需終止妊娠的46月水囊引產(chǎn)人胚胎，經(jīng)機(jī)械分離及胰蛋白酶、膠原酶消化，獲得高成活率、均一的軟骨細(xì)胞。接種于含10小牛血清的DMEM培養(yǎng)基（青霉素100 uml

8、，鏈霉素100 gml，抗壞血酸50 gml），于 CO2孵箱內(nèi)，37，5CO2飽和濕度下培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿匯合成單層后開始傳代，本實(shí)驗(yàn)傳代7次。1.3髁突軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察在原代及傳代培養(yǎng)過程中定期進(jìn)行相差顯微鏡觀察及攝影。1.4生長曲線繪制將不同傳代髁突軟骨細(xì)胞按2×104孔接種于24孔板。從接種后第1天起，隨機(jī)取孔，以0.25胰蛋白酶消化后記數(shù)，取均數(shù)描記生長曲線。1.5甲苯胺藍(lán)染色培養(yǎng)軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色參照Takigawa等人3的方法。1.6培養(yǎng)軟骨細(xì)胞合成型膠原的免疫檢測取不同傳代軟骨細(xì)胞1瓶（25 ml培養(yǎng)瓶）。用0.25胰蛋白酶消化獲得細(xì)胞，用PBS洗滌兩次，離心棄上清

9、，加入1×SDS樣品緩沖液（50 mmolL Tris.cl pH 6.8，100 mmol/L二硫蘇糖醇，2SDS，10甘油）充分混勻，置100 煮沸10 min，移入冰浴，離心取上清，-20 保存?zhèn)溆?。分別取各傳代細(xì)胞提取物4 l點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜上，平行點(diǎn)樣不同稀釋濃度的成骨細(xì)胞（Mc-3T3E1）提取物，室溫干燥后裝入塑料袋，加入5 ml封閉液（5脫脂奶粉，0.02疊氮鈉，0.05吐溫-20的PBS），封袋，4 過夜。PBS洗膜后，將膜封于含型膠原單克隆抗體的（120稀釋）封閉劑，4 振蕩下孵育2 h。再次洗膜后，將膜封于含辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG的封閉液中。封袋后，

10、室溫振蕩孵育2 h。室溫洗膜10 min。最后將膜置于顯色液（4-氯奈酚10 mg，甲醇3 ml，10 mmolL pH 7.6 Tris.cl 17ml，3雙氧水15 l）顯色30 min，照相記錄。1.7培養(yǎng)軟骨細(xì)胞pro 1（）、1（）、1（）基因表達(dá)的檢測含、型膠原cDNA片段重組質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化、鑒定后，大量擴(kuò)增，經(jīng)堿裂解法抽提，限制性酶切消化后低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳回收特定cDNA片段。探針標(biāo)記按地高辛標(biāo)記試劑盒說明進(jìn)行。取不同傳代次數(shù)的髁突軟骨細(xì)胞(2×106),提取細(xì)胞總RNA。取各樣品總RNA 2 g，與等體積RNA稀釋液（20×SSC，37甲醛，體積比32），6

11、8變性15 min。將樣品點(diǎn)樣于預(yù)先用10×SSC浸泡10 min尼龍膜，80烤膜2 h。分別與地高辛標(biāo)記的、型膠原的cDNA探針進(jìn)行預(yù)雜交、雜交、顯色及灰度掃描。2結(jié)果2.1傳代軟骨細(xì)胞形態(tài)及生長變化在傳代過程中軟骨細(xì)胞形態(tài)改變顯著，原代細(xì)胞多數(shù)為圓形或多角形（1），自第3代開始出現(xiàn)長梭形細(xì)胞，到第6代以后長梭形的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞可占90以上。細(xì)胞重疊生長，呈漩渦狀，長滿單層時細(xì)胞數(shù)大于原代培養(yǎng)的細(xì)胞（2）。傳代軟骨細(xì)胞生長速度較原代快，細(xì)胞倍增時間縮短，通常長滿單層的時間為46 d(3)。1原代培養(yǎng)的人髁突軟骨細(xì)胞多數(shù)為多角形或圓形×1002第5代人髁突軟骨細(xì)胞多數(shù)為長

12、梭形×1003不同代的人髁突軟骨細(xì)胞生長曲線2.2傳代細(xì)胞型膠原及蛋白多糖的合成隨傳代次數(shù)增加，型膠原合成逐漸減少。至第7代免疫印跡方法已不能檢測出細(xì)胞裂解液中型膠原（4）。甲苯胺藍(lán)染色原代細(xì)胞著色深，傳代后的細(xì)胞染色逐漸變淺，說明軟骨細(xì)胞合成硫酸軟骨素蛋白多糖有減少趨勢。4傳代人髁突軟骨細(xì)胞型膠原的免疫印跡2.3傳代軟骨細(xì)胞、型膠原mRNA水平的變化采用斑點(diǎn)雜交的方法，檢測了不同傳代細(xì)胞總RNA中pro 1（）、1（）、1（）的相對水平。結(jié)果表明：pro 1（) mRNA水平隨傳代逐漸降低，第7代軟骨細(xì)胞幾乎不能表達(dá)pro 1（）。與之相反pro 1（）、1（）隨傳代次數(shù)增加均有顯

13、著增加（ 5，6）。5傳代過程中軟骨細(xì)胞膠原基因表達(dá)的變化6傳代人髁突軟骨細(xì)胞前膠原基因表達(dá)的變化3討論軟骨來源于未分化的間充質(zhì)細(xì)胞，胚胎時期間充質(zhì)的中胚層及神經(jīng)嵴均具有向軟骨細(xì)胞分化的能力，但只有在特定的條件下，這些細(xì)胞才能向軟骨細(xì)胞分化。目前軟骨的分化誘導(dǎo)機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)果顯示出在反復(fù)傳代過程中髁突軟骨細(xì)胞由多角形占多數(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形細(xì)胞占優(yōu)勢。并且細(xì)胞合成特異性型膠原及蛋白多糖的功能逐漸降低，、型膠原的表達(dá)逐漸升高。形態(tài)改變的軟骨細(xì)胞伴有其表型特征的喪失，這個轉(zhuǎn)化過程與大關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞反分化現(xiàn)象是一致的4。反分化是體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞發(fā)生的一種表型特征的喪失。其發(fā)生機(jī)理及影響因素目前尚不清

14、楚，但研究顯示可能與培養(yǎng)環(huán)境的變化及傳代次數(shù)有關(guān)5。通常認(rèn)為只有圓形及多角形的軟骨細(xì)胞可表達(dá)分化的軟骨細(xì)胞表型，體外反復(fù)傳代過程中細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，形狀類似于成纖維細(xì)胞。這可能因?yàn)轶w外貼壁培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的細(xì)胞骨架發(fā)生改變，而這種變化可傳遞到細(xì)胞核基質(zhì)，導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，從而影響相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄6。近來研究表明，許多因素可以調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的表型特征，如改進(jìn)培養(yǎng)方法，懸浮或半固體瓊脂培養(yǎng)方法7，加入某些因子如BMP2、IGF-等均能夠達(dá)到穩(wěn)定軟骨細(xì)胞表型、促進(jìn)其分化的作用。髁突軟骨有別于其它關(guān)節(jié)透明軟骨，研究表明髁突軟骨細(xì)胞能夠同時表達(dá)型及型膠原。而透明軟骨細(xì)胞只合成型膠原。因而不能單以出現(xiàn)

15、型膠原的合成作為軟骨細(xì)胞反分化的標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)結(jié)合型膠原、蛋白多糖合成及細(xì)胞形態(tài)變化作綜合評價8。在骨關(guān)節(jié)病及軟骨損傷異常修復(fù)中也可伴有軟骨細(xì)胞合成膠原類型的改變，并失去合成蛋白多糖基質(zhì)的功能。因反分化的軟骨細(xì)胞與之相似，因而可作為骨關(guān)節(jié)病的體外研究模型，用作探索骨關(guān)節(jié)病的發(fā)病機(jī)制，并尋找預(yù)防和控制軟骨細(xì)胞反分化的措施，以治療骨關(guān)節(jié)病9。本課題為國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號 39500164)作者單位:610041華西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科學(xué)教研室4參考文獻(xiàn)1Von Der Mark K，Conrad G. Cartilage cell differentiation.Clin Ortho

16、p Relat Res，1979，139（3）：1852052焦巖濤，王大章，田衛(wèi)東,等.人胚顳頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究.華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，1997，15（3）：1871893Takigawa M，Okada M，Taakano T，et al. Studies on chondrocytes from mandibular condylar cartilage，nasal septal cartilage and sphenooccipital synchonclosis in culture. J Dent Res，1984，63（1）：194曲綿域，陳慧會，齊劍剛,等.軟骨細(xì)胞

17、培養(yǎng)過程中細(xì)胞反分化的研究.北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1992，24（4）：3303325Gospodarowicz D，Greenburg G，Birdwell CR.Determination of cellular shape by the extracellular matrix and its correction with the control of cellular growth. Cancer Res，1978，38（11）：415541716Folkman J，Moscona A.Role of cell shape in growth control.Nature，1978，273（5661）：3453477Benya PD，Shaffer JD.Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels.Cell，1982，30（1）：2152248Milam SB, Klebe RL，Triplett RG，et al.Characterization of th