骨髓增生異常綜合征造血干祖細胞體外增殖、分化特征研究

1、    骨髓增生異常綜合征造血干/祖細胞體外 增殖、分化特征研究         我們對骨髓增生異常綜合征(MDS)患者骨髓CD34細胞進行檢測和富集，并對富集后的骨髓細胞進行體外培養(yǎng)，以研究其增殖分化特征及對不同造血因子的反應。病例和方法1病例來源1993年3月1997年10月于我院住院的MDS患者29例，其中男性20例，女性9例；中位年齡37歲(2465歲)。按FAB診斷及分型標準111例為低危組(RA/RAS)，18例為高危組(RAEB/RAEB-t)。2試劑

2、來源所用單克隆抗體包括抗T細胞(CD3、CD2）、NK細胞(CD56)、B細胞(CD20)、粒細胞(CD11b)、紅細胞(血型糖蛋白A-HIR2)抗體及其兔抗鼠二抗由我所免疫室提供，所用紅細胞生成素(Epo)、重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)、重組人干細胞因子(rhSCF)、重組人白細胞介素3(rhIL-3)由麒麟公司惠贈，重組人粒-巨噬細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)由先靈葆雅公司提供。3實驗方法3.1標本的采集：無菌采集肝素抗凝MDS及正常志愿獻髓者髂骨或胸骨骨髓，密度梯度離心法分離骨髓單個核細胞(MNC)。3.2造血干細胞的富集：去除單核細胞：采用粘附法去除MNC中的單核細

3、胞，即為M-MNC。陰性選擇(Panning法)富集CD34細胞：用不同的單克隆抗體(包括T-細胞、B-細胞、成熟粒細胞、紅細胞)與M-MNC反應，以清除T淋巴細胞、B淋巴細胞、成熟粒細胞、紅細胞，即為富集后的造血干細胞(M-Ab-MNC)。3.3CD34細胞的檢測：采用免疫熒光法。3.4體外生長特征分析：對M-Ab-MNC進行體外培養(yǎng)，觀察長勢。粒-巨噬系祖細胞(CFU-GM)集落和(或)集簇：1×105/L M-Ab-MNC 30g/L瓊脂、體積分數(shù)為30%的小牛血清、10g/L谷氨酰胺的IMDM培養(yǎng)體系中，單獨加入造血生長因子G-CSF(40ng/ml)、GM-CSF(100n

4、g/ml)、SCF(100ng/ml)、IL-3(40ng/ml)或加入不同組合造血生長因子(G-CSF+SCF、GM-CSF+SCF、IL-3+SCF)，孵育于體積分數(shù)為5%的CO2孵箱，觀察1014d時集落和集簇數(shù)。爆式紅系祖細胞(BFU-E)和紅系祖細胞(CFU-E)集落：2×104/L M-Ab-MNC 300g/L甲基纖維素、100g/L牛血清白蛋白、體積分數(shù)為1%的二巰基乙醇、體積分數(shù)為30%的小牛血清、10g/L谷氨酰胺的IMDM培養(yǎng)體系中，加入Epo(2U/L)、Epo+IL-3(40ng/ml)和Epo+IL-3+SCF(100ng/ml)等造血生長因子培養(yǎng)于體積分

5、數(shù)為5%的CO2孵箱，觀察BFU-E(1014d)、CFU-E(57d)集落產(chǎn)率。4統(tǒng)計方法采用t檢驗。結(jié)果1骨髓單個核細胞CD34表達率的測定1.1對29例MDS患者和6名志愿獻髓者骨髓單個核細胞CD34抗原陽性表達率進行了檢測，結(jié)果MDS患者骨髓單個核細胞中CD34細胞明顯高于正常對照組，陽性表達率分別為7.03%和2.50%(P<0.01)，尤以高危組為著，高、低危組陽性率分別為9.65%和2.70%。1.2富集后CD34細胞比例為23.24%，平均富集倍數(shù)為3.3倍。富集后高、低危組MDS患者CD34陽性細胞比例(分別為24.12%和21.14%)雖高于正常對照組(17.7%)，

6、但差異無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。2CFU-GM體外集落產(chǎn)率2.14種造血因子(rhSCF、rhIL-3、rhGM-CSF、rhG-CSF)單用和合用(rhSCF+rhIL-3、rhSCF+rhGM-CSF、rhSCF+rhG-CSF)對MDS患者富集后的CD34細胞進行CFU-GM培養(yǎng)，結(jié)果MDS患者CFU-GM集落產(chǎn)率明顯低于正常組，而且主要以集簇為主，集落數(shù)明顯少于集簇，而正常對照組則以集落為主，集簇少于集落數(shù)(表1)。2.2低危組MDS患者CFU-GM產(chǎn)率明顯高于高危組MDS患者，且集簇與集落之比明顯降低(表2)。2.3MDS患者骨髓富集后的CD34細胞對上述4種造血因子的

7、反應存在差別，對rhGM-CSF反應較好，并用rhSCF后可增加CFU-GM集落的產(chǎn)率，有利于集落的形成，而在rhIL-3單用或并用rhG-CSF因子體系中CFU-GM的產(chǎn)率均較低(表1，2)。3體外BFU-E和CFU-E長勢MDS患者BFU-E和CFU-E集落產(chǎn)率均明顯高于正常對照組(表3)。在Epo、Epo+rhIL-3及Epo+rhIL-3+rhSCF體系中隨著造血因子的并用其BFU-E逐漸增多。高危組MDS患者BFU-E產(chǎn)率明顯低于低危組MDS患者(表3)。4對5例MDS患者予標準聯(lián)合化療(柔紅霉素40mg.m-2.d-1 ×3d和阿糖胞苷100mg.m-2.d-1×

8、;7d)和造血因子(Epo+rhG-CSF,rhG-CSF 300g/d,Epo 6000U/d，于停化療后24h開始，連續(xù)57d)的治療方案，其中2例患者1個療程后獲完全緩解(CR)，1例2個療程后獲CR，追蹤觀察68個月仍處于CR；2例治療3個療程無效而死亡。3例緩解的患者BFU-E生長良好，且CFU-GM生長也好于2例無效的患者。討論本組研究結(jié)果表明，MDS患者骨髓干/祖細胞(CD34)數(shù)量雖高于正常，但其功能受到了嚴重的損害，在正常造血因子的調(diào)控下，CFU-GM集落形成能力明顯減低，表現(xiàn)為集落產(chǎn)率明顯減少，同時存在著分化異常，集簇明顯多于集落，對各種造血因子反應降低，即使聯(lián)合使用SCF

9、，其集落、集簇產(chǎn)率仍然明顯減少，與國外報道相似2-5。表明MDS患者造血系統(tǒng)的改變是骨髓干/祖細胞本身質(zhì)的異常所致，而非血清中存在其它抑制因子。雖然MDS患者骨髓CD34細胞對不同的造血因子反應存在異質(zhì)性，但大部分患者骨髓干/祖細胞，在rhIL-3、rhG-CSF、rhGM-CSF和rhSCF 4種因子中對GM-CSF反應相對較好，其集落、集簇形成的能力較強，提示GM-CSF能部分促進MDS造血干/祖細胞的增殖和分化，為臨床選擇造血因子治療MDS提供依據(jù)。表1正常對照組和MDS患者富集后CD34細胞在造血生長因子刺激下的CFU-GM產(chǎn)率(/1×105組別例數(shù)G-CSFGM-CSFIL

10、-3G-CSF+SCFGM-CSF+SCFIL-3+SCF正常對照組集簇51.00±0.161.00±0.473.00±1.124.20±1.011.40±0.311.00±0.42集落516.40±5.2735.60±7.4020.80±5.0725.60±7.0951.60±7.2728.00±5.83MDS組集簇265.20±2.0112.20±3.2421.90±9.3629.10±11.6221.10±8.6113.

11、90±5.40集落261.40±0.154.30±0.515.60±1.917.30±2.012.10±0.145.70±2.21     表2MDS患者高、低危組富集后CD34細胞在造血生長因子刺激下的CFU-GM產(chǎn)率(/1×105組別例數(shù)G-CSFGM-CSFIL-3G-CSF+SCFGM-CSF+SCFIL-3+SCFMDS高危組集簇1520.20±9.7326.20±8.9710.20±7.4319.20±8.5710.00&#

12、177;4.8422.50±11.08集落153.30±2.312.90±1.830.80±1.211.90±0.570.20±1.453.70±2.43MDS低危組集簇925.50±12.8135.50±15.3410.20±5.0719.20±8.6610.00±4.3422.50±13.64集落910.60±6.506.70±3.515.20±3.6514.00±9.874.20±2.215.70±3

13、.21     表3正常對照組和MDS患者富集后CD34細胞在造血生長因子刺激下的BFU-E和CFU-E產(chǎn)率(/2×104組別例數(shù)BFU-ECFU-EEpoEpo+IL-3Epo+IL-3+SCFEpoEpo+IL-3Epo+IL-3+SCF正常對照組537.00±7.7181.60±13.1898.00±16.1655.00±10.8481.00±19.43141.00±17.42MDS組25106.10±37.01152.90±46.37171.40±

14、54.38112.60±41.01189.30±55.95234.40±71.14高危組1488.20±32.31138.00±43.19148.40±41.4394.90±36.41185.40±58.04220.80±71.15低危組9172.70±48.41212.70±69.25292.90±88.31182.70±61.08204.00±58.47284.20±71.23     MDS患者骨髓富

15、集純化后CD34細胞紅系集落生長過度旺盛，即使在單獨的Epo作用下，高危的MDS患者紅系集落仍然生長良好，這與國外報道的不相一致6-8。在加用rhIL-3或并用rhIL-3與rhSCF后，其紅系集落生長更為旺盛，但此組患者均有不同程度的難治性貧血，而且缺乏紅細胞破壞過多的證據(jù)，此類紅系集落生長與外周血血紅蛋白值不相一致的現(xiàn)象，有待進一步研究?？傊?，我們的研究結(jié)果表明，MDS患者骨髓造血干/祖細胞數(shù)量及質(zhì)量上均存在異常，且主要為質(zhì)的異常。對于體外紅系和粒系集落生長較好的患者采用標準化療加造血因子治療有利于提高其療效。 基金項目：中國醫(yī)學科學院基金(952040)、衛(wèi)生部臨床重點項目基金

16、(0007)、天津市自然科學基金資助項目(953608811)作者單位：陳桂彬（天津，中國醫(yī)學科學院、中國協(xié)和醫(yī)科大學血液學研究所、血液病醫(yī)院300020）邵宗鴻（天津，中國醫(yī)學科學院、中國協(xié)和醫(yī)科大學血液學研究所、血液病醫(yī)院300020）賈海蓉（天津，中國醫(yī)學科學院、中國協(xié)和醫(yī)科大學血液學研究所、血液病醫(yī)院300020）鄭以州（天津，中國醫(yī)學科學院、中國協(xié)和醫(yī)科大學血液學研究所、血液病醫(yī)院300020）張益枝（天津，中國醫(yī)學科學院、中國協(xié)和醫(yī)科大學血液學研究所、血液病醫(yī)院300020）儲榆林（天津，中國醫(yī)學科學院、中國協(xié)和醫(yī)科大學血液學研究所、血液病醫(yī)院300020）郝玉書（天津，中國醫(yī)學科

17、學院、中國協(xié)和醫(yī)科大學血液學研究所、血液病醫(yī)院300020）參 考 文 獻1，Third MIC Cooperative Study Group. Recommendations for a morphologic, immunologic, and cytogenetic (MIC) working classification of the primary and therapy-related myelodysplastic disorders. Cancer Gen Cytogenet, 1988, 32:1-10.2，List AF, Garewal HS, Sandberg AA.

18、 The myelodysplastic syndromes: biology and implications for management. J Clin Oncol, 1990, 81:1424-1441.3，Geissler K, Hinterberger W, Bettelheim P. Colony growth characteristic in chronic myelomonocytic leukemia. Leuk Res, 1998,12:373-377.4，Sullivan SA, Marsden KA, Lowenthal RM, et al. Circulating CD34 cells: an adverse prognostic factor in the myelodysplastic syndromes. Am J Hematol, 1992, 39:96-101.5，San Miguel JF, Sanz GF, Vallespi T,