間充質(zhì)干細胞移植治療椎間盤退變疾病的研究進展

1、502.21,No.5ChineseJournalofReparativeandReconstructiveSurgery,May2007,Vol間充質(zhì)干細胞移植治療椎間盤退變疾病的研究進展梁濤劉浩【摘要】目的綜述間充質(zhì)干細胞(mesenchymalstemcells,MSCs)移植治療椎間盤退變疾病的研究現(xiàn)狀。方法查閱近年來有關MSCs移植治療椎間盤退變疾病的國內(nèi)外相關文獻,進行回顧及綜合分析。結(jié)果椎間盤移植結(jié)論MSCs在一定的條件下能表達類軟骨細胞表型,增加基質(zhì)合成,緩解椎間盤退變。MSCs移植治療椎間盤退變疾病是一種很有前途的方法?！娟P鍵詞】間充質(zhì)干細胞椎間盤退變中圖分類號:R68115

2、Q813文獻標識碼:AADVANCESOFMESENCHYMALSTEMCELLSTRANSPLANTATIONFORTREATINGINTERVERTEBRALDISC.DepartmentofOrthopeadics,WestChinaHospital,SichuanUniverstiy,DEGENERATION LIANGTao,LIUHaoChengduSichuan,610041,P.R.China.E2mail:LiangTao1234Correspondingauthor:LIUHao,E2mail:liuhao640812【Abstract】ObjectiveTointrodu

3、cetheresearchofmesenchymalstemcells(MSCs)transplantationfortreatingintervertebraldiscdegeneration.MethodsTherecentoriginalarticlesabouttheMSCstransplantationfortreatingintervertebraldiscdegenerationwereextensivelyreviewed.ResultsTransplantedMSCsinintervertebraldisccanexpresschrondcyte2likephenotypei

4、ncertainconditions,increasematrixsynthesisandreleaseintervertebraldiscdegeneration.ConclusionMSCstransplantationfortreatingintervertebraldiscdegenerationmaybeafutureapproach.【Keywords】MesenchymalstemcellsIntervertebraldiscDegenerationFoundationitem:NationalNaturalScienceFoundationofChina(30572163)椎間

5、盤退變疾病是指由椎間盤退變引起的以頸肩腰背痛為主要表現(xiàn)的臨床癥候群,已逐漸成為當前脊柱疼痛的主要病因,也是導致45歲以上人群勞動能力喪失的主要原因。椎間盤退變導致脊柱的生物力學功能紊亂,從而影響脊柱的功能。目前對該疾病的治療尚無很好的手段。傳統(tǒng)的治療方法有保守治療和手術治療,可以在一定程度上緩解部分臨床癥狀,但同時也會產(chǎn)生較多的并發(fā)癥,從根本上并未解決椎間盤本身的病變問題。自20世紀90年代提出間充質(zhì)干細胞(mesenchymalstemcells,MSCs)概念,利用其修復組織損害和促進功能恢復的治療方法成為目前醫(yī)學領域中最引人關注的熱點之一。已有的研究結(jié)果顯示,移植MSCs可能成為治療椎間

6、盤退變疾病的一種新的治療方法1。1椎間盤的解剖和營養(yǎng)供應特點1.1解剖特點減緩沖擊,提供脊柱穩(wěn)定性,并保持脊柱一定活動范圍的重要結(jié)構(gòu)。椎間盤由骨性終板、軟骨終板、外層纖維環(huán)和內(nèi)層髓核組成。后兩種結(jié)構(gòu)在組織學上可分為四個不同區(qū)域,包括外層纖維環(huán)、內(nèi)層纖維環(huán)、移行區(qū)和髓核。髓核富含蛋白多糖,為一種半流體樣團塊,而纖維環(huán)富含膠原,為薄片分層纖維組成2。椎間盤的細胞有脊索細胞、類軟骨細胞和成纖維細胞。纖維環(huán)的外層主要為成纖維細胞,內(nèi)層為類軟骨細胞。脊索細胞主要存在于胚胎期的髓核內(nèi),正常人10歲后消失。壓力對椎間盤纖維環(huán)細胞和髓核的形成起重要作用。椎間盤細胞處于三維環(huán)境中,周圍是豐富的細胞外基質(zhì),主要為

7、膠原和蛋白聚糖。膠原提供椎間盤的可拉伸性,而蛋白多糖提供椎間盤的硬度、抗壓性和黏彈性。椎間盤細胞的形態(tài)、表型、增殖及膠原和蛋白多糖等基質(zhì)的合成在脊柱長期負重過程中會不斷發(fā)生變化,若椎間盤出現(xiàn)退變,就可能導致腰背疼痛3,4。1.2營養(yǎng)供應特點椎間盤為椎體間連接組織,是人體脊柱吸收震蕩、基金項目:國家自然科學基金資助項目(30572163)作者單位:四川大學華西醫(yī)院骨科(成都,610041)通訊作者:劉浩,教授,博士導師,研究方向:脊柱外科,E2mail:liuhao640812椎間盤是體內(nèi)最大的無血管組織,中間區(qū)域無直接血管供應,離最近的血管也有68mm。椎間盤主要依靠軟骨終板通路和纖維環(huán)外周通

8、路供應,如:氧、葡萄糖、氨基酸和硫酸鹽等基本營養(yǎng)5。Bydder等6通過數(shù)學模型和精細成像方法證實,人椎間盤營養(yǎng)通中國修復重建外科雜志2007年5月第21卷第5期路主要由彌散作用控制。軟骨終板作為彌散的一道屏障,僅允許小的不帶電的分子進出椎間盤。營養(yǎng)成分從椎間盤周邊的毛細血管經(jīng)細胞外基質(zhì),到達位于髓核中心的細胞,而代謝廢物通過逆向通路移出組織。椎間盤細胞需營養(yǎng)來保持活性和功能。細胞主要能量供應來自糖分解,大量消耗葡萄糖和生成乳酸。代謝生成的乳酸使椎間盤內(nèi)的pH值保持在619712。如pH值降至614以下,可損害細胞活力;當葡萄糖濃度降至015mmol L以下,并持續(xù)數(shù)天后細胞開始死亡。低氧環(huán)境

9、下,細胞失活,基質(zhì)合成大量減少,加劇椎間盤進一步退變7。Bibby等8發(fā)現(xiàn)酸性環(huán)境中牛髓核細胞活力下降,當伴有葡萄糖含量降低,細胞活力下降更多。1.3細胞表型特征椎間盤的細胞外基質(zhì)主要為膠原和蛋白聚糖。成纖維細胞表達 型膠原,耐受張力及應力;成人的髓核細胞多為類軟骨細胞,主要表達具有軟骨表型特征的蛋白多糖和 型膠原,在椎間盤承受壓力方面起關鍵作用; 型膠原含量很少,分布于纖維環(huán) 、 型膠原移行區(qū)9。蛋白聚糖在椎間盤中主要以聚合蛋白聚糖的形式存在,髓核中含量較多。2椎間盤退變的特點2.1分子生物學基礎椎間盤退變的分子生物學基礎包括髓核細胞退變、髓核細胞外基質(zhì)退變、軟骨終板和纖維環(huán)退變。椎間盤退變

10、是一個復雜的過程,起源于髓核,由于細胞因子的減少和致炎因子的增多,導致基質(zhì)金屬蛋白酶活性增加,椎間盤軟骨樣細胞分泌蛋白多糖和 、 型膠原能力下降,降解加速,進而使椎間盤軟骨樣細胞賴以生存的細胞外環(huán)境被破壞,髓核內(nèi)水分喪失,不能維持椎間盤內(nèi)應有的張力,加劇細胞退變。細胞滲透功能的減退和細胞過度凋亡是髓核細胞退變的主要因素。椎間盤細胞分泌的基質(zhì)合成與分解代謝不平衡是椎間盤退變的主要特征之一。這種決定性的生物合成平衡被打斷,導致椎間盤基質(zhì)蛋白合成減少,增加分解代謝的酶類及炎性介質(zhì)的表達。Benneker等10研究發(fā)現(xiàn)椎間盤骨性終板內(nèi)通道的大小、密度與椎間盤退變密切相關,通道阻塞可能是細胞營養(yǎng)不足、基

11、質(zhì)合成下降而導致髓核退變的原因。當退變發(fā)生后,椎間盤細胞凋亡,蛋白多糖丟失和膠原表達改變。特別是 型膠原表達減少,并出現(xiàn) 型膠原的表達。在椎間盤退變區(qū) 、 型膠原明顯增加而 型膠原明顯減少。蛋白多糖中二聚糖和核心蛋白多糖增加11。5032.2組織病理學特征椎間盤退變的表現(xiàn)為椎間盤高度的丟失,以及纖維環(huán)及髓核大體形態(tài)學特征模糊。由于椎間盤組織細胞數(shù)量減少,生理活性降低,細胞外基質(zhì)(尤其是膠原構(gòu)成成分的變化)改變,髓核出現(xiàn)退變,在壓力的作用下,纖維環(huán)也出現(xiàn)退變,失去層狀結(jié)構(gòu),并產(chǎn)生放射狀的小裂痕,膠原纖維斷裂、鈣化、玻璃樣變,甚至瘢痕化,髓核通過裂痕區(qū)帶可以向外突出。椎間盤內(nèi)的組織可突破軟骨終板,

12、進入椎體內(nèi)形成結(jié)節(jié),肉芽組織生長進入裂痕,纖維組織增生呈團塊狀、分支狀和帶狀。軟骨下骨或終板逐漸出現(xiàn)鈣化,軟骨終板消失12。椎間盤的營養(yǎng)主要靠軟骨終板的滲透作用,因而極易發(fā)生退變;且髓核和纖維環(huán)細胞的體內(nèi)分裂增殖能力差,椎間盤組織再生和修復能力有限,這些特點決定了椎間盤組織移植修復的必要性。3用于修復退變椎間盤的MSCs來源及特性3.1干細胞的定義干細胞是人體及各種組織細胞的最初來源,具有高度自我更新、增殖、多向分化潛能、可植入性和重建能力等特征。這些細胞可通過細胞分裂維持自身細胞群的大小,同時又可進一步分化為各種不同的組織細胞,從而構(gòu)成機體復雜的組織器官。干細胞取材較方便,來源較廣泛,且自體

13、干細胞不存在免疫排斥問題,是組織工程學理想的種子細胞之一13。3.2MSCs名稱的由來Fridenstein(1968)在全骨髓培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)少量克隆化、非吞噬性和呈紡錘形成纖維細胞樣生長的貼壁細胞,稱為成纖維細胞集落形成單位。而最引人注目的是這些細胞在體外可分化為骨和軟骨組織。Piersma等(1985)用Fridenstein相同的分離方法對其進行研究,發(fā)現(xiàn)這些細胞可分化為骨、軟骨、脂肪,甚至肌肉組織等各種間充質(zhì)組織。Owen(1985)認為骨髓基質(zhì)細胞系統(tǒng)是伴隨造血干細胞系統(tǒng)生長的,可以自我更新并分化為各種間充質(zhì)組織的細胞群,由此提出骨髓基質(zhì)干細胞的概念。Pittenger等14利用梯度離心

14、法,在骨髓中分離出成纖維樣貼壁細胞,并且可以重復出Fridenstein等所進行的成纖維細胞集落形成單位細胞特性的實驗,鑒于它們可以分化為MSCs,所以定義為間充質(zhì)干細胞,而將骨髓來源的干細胞群,命名為骨髓間充質(zhì)干細胞(bonemesenchymalstemcells,BMSCs)。3.3MSCs的特性MSCs存在于少數(shù)骨膜和骨髓中未分化細胞,有向間葉來源的連接組織細胞分化的獨特能力,在一定504.21,No.5ChineseJournalofReparativeandReconstructiveSurgery,May2007,Vol條件下能分化為骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞及肌細胞,并釋放多種

15、細胞因子和生長因子。它易分離和培養(yǎng),可用于骨、軟骨或肌腱的再生,在活體內(nèi)具有高擴張潛力,使這類細胞成為一種能在臨床廣泛應用的細胞和基因治療的工具15。MSCs來源較廣,Li等16用成年新西蘭白兔腹股溝區(qū)皮下脂肪組織在不同的條件下在試管中復合培養(yǎng)分化出脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞和肌肉細胞,其中與髓核復合培養(yǎng),與單獨藻酸鹽和細胞纖維環(huán)復合培養(yǎng)相比, 型膠原和聚集蛋白多糖表達增加。可以用脂肪作為其大量易得的來源。Steck等17從分子表型上對MSCs與關節(jié)軟骨細胞進行比較,指出它與自然的椎間盤組織較關節(jié)軟骨細胞有更相似的一種基因表達,這些細胞可以成為一種有吸引力的資源來獲得類椎間盤細胞。由于MSCs

16、能表達類軟骨細胞表型,因此在用于椎間盤疾病的治療上越來越受到關注,一些實驗表明MSCs在椎間盤疾病的治療上有廣闊的前景。4MSCs的體外培養(yǎng)研究4.1體外分離和培養(yǎng)系統(tǒng)目前用于分離MSCs的方法主要有三種,即密度梯度離心法、流式細胞儀分離法和貼壁篩選法。貼壁篩選法操作簡便,細胞易于成活,為一種較好的方法。MSCs培養(yǎng)方式有三維支架培養(yǎng)、細胞團培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、微囊化培養(yǎng)等。三維支架培養(yǎng)是組織工程中最典型的培養(yǎng)方式。將細胞通過各種方法接種于三維支架材料,形成細胞2支架結(jié)構(gòu)體,然后在培養(yǎng)系統(tǒng)中以適當?shù)臈l件培養(yǎng),使細胞增殖分化并分泌特異性細胞外基質(zhì),最終形成工程組織。用于MSCs構(gòu)建工程組織的培養(yǎng)系

17、統(tǒng)大致有四種:孔板和培養(yǎng)皿、轉(zhuǎn)瓶、旋轉(zhuǎn)壁式生物反應器及灌注生物反應器系統(tǒng)。其中旋轉(zhuǎn)壁式生物反應器有水平放置的內(nèi)外兩個同心圓柱組成,內(nèi)柱由可進行氣體交換的半透膜構(gòu)成,外柱由非通透性材料制成,內(nèi)外柱間充以培養(yǎng)介質(zhì)。根據(jù)培養(yǎng)介質(zhì)的量調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速,使細胞2支架結(jié)構(gòu)體或微載體受到的離心力與重力達到平衡,可產(chǎn)生微重力培養(yǎng)環(huán)境,既強化了傳遞,又降低了剪切力,已廣泛用于組織工程18,19。此外,灌注生物反應器系統(tǒng)也被廣泛應用于MSCs組織工程研究中20。4.2體外培養(yǎng)MSCs在組織工程三維培養(yǎng)中需經(jīng)歷細胞增殖、細胞分化和組織形成三階段。在培養(yǎng)中加入生化因素不僅維持細胞增殖,也促進細胞分化。血清在MSCs的體外生長

18、中十分重要,有助于其貼壁、擴增以及多向分化潛能的維持。Kobayashi等21認為在促進MSCs生長和保持較高的活力上用自體人血清較胎牛血清更好。另外多種激素、細胞因子和細胞外基質(zhì)蛋白均對誘導結(jié)果產(chǎn)生影響。Li等22取14例手術患者的椎間盤組織在試管中進行培養(yǎng)4896h后檢測18種細胞因子,有12種陽性,認為在條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)椎間盤組織,可以刺激MSCs增殖。Richardson等23采用復合培養(yǎng)實驗在有或無細胞接觸狀況下,觀察人髓核細胞是否能引起MSCs分化。細胞2細胞接觸復合培養(yǎng)實驗后熒光標記細胞群和高速細胞分揀允許檢查單一的細胞群。當在接觸后的第7天即時定量PCR顯示,髓核2標記基因在干

19、細胞有顯著增加,并受調(diào)于細胞比例。無接觸的培養(yǎng)顯示不論細胞比例如何,在髓核細胞或干細胞中髓核2標記基因表達均無明顯增加。人髓核和MSCs接觸復合培養(yǎng)是一種有效的方法,能為退變椎間盤的再生提供一大群分化細胞,并能被用于以細胞為基礎的組織工程治療。Yamamoto等24將MSCs與髓核細胞共同培養(yǎng),結(jié)果顯示可促進髓核細胞增殖和基質(zhì)合成。Sobajima等1將MSCs與髓核細胞共同培養(yǎng),通過檢測發(fā)現(xiàn)MSCs在椎間盤環(huán)境中有良好的增殖能力,并可以將治療基因帶入椎間盤。LeVisage等25用MSCs與取自退變椎間盤的纖維環(huán)細胞混合培養(yǎng)14d后,觀察到蛋白多糖顯著增加,認為用取自退變椎間盤的細胞與MSC

20、s混合培養(yǎng),可能會誘導其表達椎間盤細胞表型。4.3細胞定向誘導分化和控制在體內(nèi)條件下,影響MSCs分化的因素很多,除了局部微環(huán)境及其他相鄰細胞的影響外,細胞因子的刺激也是一個重要的因素。其中轉(zhuǎn)化生長因子1(transforminggrowthfactor1,TGF21)不僅可以調(diào)控MSCs增殖和向類軟骨定向分化,而且可以抑制多種炎性介質(zhì)的生物學活性,同時還是一種強烈的免疫抑制劑,使同種異體細胞移植更為安全。利用轉(zhuǎn)基因技術將外源性目的基因轉(zhuǎn)入種子細胞,通過轉(zhuǎn)基因細胞在局部持續(xù)高效表達高生物活性的內(nèi)源性生長因子,可能使基因強化組織工程中生長因子目的蛋白的表達應能達到持久、穩(wěn)定26。Risbud等2

21、7用MSCs在適當?shù)奈h(huán)境(低氧、生長因子,三維立體培養(yǎng))中可以分化出類髓核細胞。此后他們實驗在三維藻酸鹽水凝膠劑中放入含有TGF21的培養(yǎng)基,分別在低氧(2%)和正常含氧(20%)下培養(yǎng)。在低氧和TGF21驅(qū)動下間充質(zhì)干細胞向與髓核表型一致的細胞分化,低氧環(huán)境可以促進MSCs向髓核細胞的特異標志分化,而TGF21則可以升高細胞內(nèi)促分裂原活化蛋白激酶活性以及SOX29、蛋白聚糖和 膠原的表達。得出MSCs可以用于損害的或退變的椎間盤修復28。中國修復重建外科雜志2007年5月第21卷第5期5MSCs的體內(nèi)植入研究MSCs體內(nèi)植入的方式目前多采用直接注射方式。采用外科手術暴露椎間盤后,用針頭插入

22、椎間盤中央髓核區(qū),然后注射MSCs懸液。注射的椎間盤作標記后縫合切口。5.1單純MSCs注射研究Sakai等29用綠色熒光蛋白標記的自體MSCs移植入成熟的家兔,在移植后的48周,在移植區(qū)域連續(xù)計數(shù),分化的移植細胞進行免疫組織化學分析。結(jié)果顯示MSCs移植到退變的家兔椎間盤后,增殖和分化細胞表達出一些主要髓核細胞的表型特征。Zhang等30用兔同種異體MSCs注射入兔的椎間盤,與未注射組和注射鹽水組在1、3和6個月時分別檢測mRNA,蛋白多糖和 型膠原含量,結(jié)果顯示注射MSCs組均明顯增加。注射MSCs可能是一種治療退變椎間盤的方法。Sakai等31將MSCs在家兔退變椎間盤模型制成2周后,分

23、別移植入L2、3、L3、4及L4、5椎間盤,24周后檢查正常椎間盤、模擬手術椎間盤和移植后椎間盤的X線片椎間盤高度、MRIT2信號的改變,組織學、免疫組織化學和基質(zhì)關聯(lián)的基因表達。結(jié)果顯示移植MSCs組椎間盤的高度為正常對照組的91%、T2信號強度為正常對照組81%,免疫組織化學和基因表達分析有蛋白多糖積聚。認為MSCs移植對退變的家兔椎間盤的再生是有效的,對于退變的椎間盤疾病是一個有價值的治療方法。5.2組織工程移植研究將MSCs移植到支架上,加入細胞因子等,在一定的條件下體外培養(yǎng)后移植入椎間盤從而改善椎間盤退變。Sakai等32將自體MSCs植入Atelocollagen支架后再植入兔退變

24、的髓核內(nèi),結(jié)果移植后細胞存活并成功繁殖。他們認為通過MSCs2Atelocollagen支架復合物可以填充空的髓核,移植的MSCs轉(zhuǎn)化細胞產(chǎn)生的蛋白多糖,阻止了蛋白多糖含量的下降,其可緩解椎間盤退變。Crevensten等33用MSCs注射入鼠尾骨的椎間盤,使用15%的透明質(zhì)烷凝膠作為載體,分有或無MSCs的凝膠注射,在注射椎間盤區(qū)域觀察到熒光標記的干細胞,在第7、14、28天分別進行觀察,顯示MSCs能在鼠椎間盤中維持生存力和增殖。Dang等34認為用熱敏的殼聚糖凝膠作為載體,可以用于遞送干細胞以促進一個生物學上相關的退變椎間盤重建。5.3營養(yǎng)途徑椎間盤的外層有纖維環(huán)保護,能將MSCs很好的

25、包被在椎間盤中,并向髓核細胞表型分化。植入的MSCs種植于支架上,理論上能提高細胞的黏性,并能505夠讓細胞開始產(chǎn)生新的細胞外基質(zhì)。TGF21能誘導多種細胞合成和分泌細胞外基質(zhì)蛋白,刺激膠原和其他基質(zhì)成分沉積,阻斷纖維蛋白酶原抑制劑,促進血管生成35,可能為植入的MSCs提供了營養(yǎng)途徑。6展望從理論上看,用MSCs移植入椎間盤,使椎間盤再生可能是治療椎間盤疾病較好的方法,但椎間盤研究只是處于動物實驗階段。目前禁止在人體內(nèi)進行試驗。椎間盤退變的確切機制尚待進一步研究,在退變椎間盤中移植的細胞的類型、細胞移植是否用支架,以及細胞移植后的營養(yǎng)途徑等問題需深入研究,確定細胞表形的特征,誘導和控制MSC

26、s分化成髓核或纖維環(huán)細胞的因子為下一步研究重點。隨著組織工程學的發(fā)展,及人們對脊柱基礎研究的深入,應用組織工程技術完全有希望培育出具有生物活性和功能的人工生物椎間盤組織,為脊柱退變性疾病的治療帶來新的觀念和模式。7參考文獻1SobajimaS,ShimerA,KimJ,etal.Feasibilityofstemcelltherapyforintervertebraldiscdegeneration.SpineJ,2004,4:1172186.2GruberHE,HanleyENJr.Ultrastructureofthehumanintervertebraldiscduringagingan

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