WesternBlot實驗詳細步驟

1、Western Blot實驗技術(shù)1、 制膠SDS-PAGE分離膠配方表1、 檢查制膠器是否漏水，吸干玻璃中水分2、 配置分離膠，加入玻璃板中（注意：不能有氣泡和雜物），距離玻璃上口1.5mL停止加膠。3、 再加ddH2O或異丁醇水封除去氣泡，凝膠后倒掉水，吸干水到濃縮膠插梳。2、 上樣1、 先在內(nèi)槽加滿電泳液才可以拔梳子。2、 拔梳子時垂直向上拔出，不可左右搖晃梳子。3、 拔完梳子后觀察梳子孔，是否有缺口和歪，用針頭撥正。4、 上樣時從左到右依次上樣。5、 若上樣組不多時，左右第一孔不加樣。6、 要預(yù)留Marker的上樣孔。3、 電泳4、 轉(zhuǎn)膜PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylid

2、ene fluoride）是蛋白質(zhì)印跡法中常用的一種固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔徑有大有小，隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量的蛋白結(jié)合就越牢固。 （ 轉(zhuǎn)膜緩沖液：需4度預(yù)冷，現(xiàn)配現(xiàn)用，不能放太久。）1、 轉(zhuǎn)印濾紙：全膠長8.5cm，寬5.5cm，需剪裁成7層濾紙，壓平后約3mm。需在轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡浸泡備用。2、 海綿墊：在轉(zhuǎn)膜液中平衡浸泡備用。3、 PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm ，需在甲醇中浸潤2min（活化膜上正電基團），然后在轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡浸泡備用。4、 凝膠：凝膠也需要在預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡浸泡35分鐘。否則在轉(zhuǎn)膜過程中會出現(xiàn)皺縮，導(dǎo)致出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的條帶變形。

3、 三明治夾心法：負(fù)極（黑）-海綿墊-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-海綿墊-正極（白） 轉(zhuǎn)膜時間：通電恒流，60V，一個槽100mA左右，1h （注意：在操作過程中用玻棒趕走氣泡。 裝置轉(zhuǎn)膜儀時注意黑對黑（負(fù)對負(fù)），白對紅（正對正）。 裝置運行時需冰浴。）5、 封閉 在進行抗體雜交之前，需要先對轉(zhuǎn)印膜進行封閉，以防止抗體對非轉(zhuǎn)印蛋白區(qū)域的非特異性吸附。 封閉一般采用異源性蛋白質(zhì)或去污劑，本實驗室常用的有5%BSA，10%脫脂奶等，至于選擇哪一類封閉液，首先應(yīng)考慮與檢測目的相適應(yīng)（做l酪氨酸磷酸化時不推薦non-fat milk 封閉）。1、 將脫脂奶粉封閉液（1xTBST:脫脂奶粉=20mL：2g

4、一塊膜用量。牛血清蛋白、5%BSA效果更好）倒好。2、 將PVDF膜取出放入封閉液中，蓋子改好。3、 封膜一般常溫1-2小時即可，也可4封閉過夜。6、 一抗抗體反應(yīng)主要采用間接法: 即先加入未標(biāo)記特異性一抗與膜上抗原結(jié)合后，再加入標(biāo)記的二抗進行雜交檢測，標(biāo)記二抗物質(zhì)有放射性核素，酶，以及生物素等。1、 將封閉后的雜交膜，在搖床上用TBST洗膜3次×5min，2、 加入經(jīng)TBST稀釋的一抗（用血清封閉液）3、 4孵育過夜或室溫?fù)u動孵育2-4小時回收一抗稀釋液7、 洗膜1、之后，在搖床上用TBST洗膜3次×5min，8、 二抗1、 加入標(biāo)記的二抗室溫1-2小時，二抗不回收注意：

5、一抗稀釋液（稀釋2000到4000）及孵育條件，孵育時間最好嚴(yán)格按說明書要求來做。例如：CST某些磷酸化抗體要求5%BSA稀釋液稀釋，4平緩震蕩過夜。根據(jù)不同的目的條件和目標(biāo)抗體，可剪膜后孵育抗體，即便做單一條帶，仍推薦剪膜，在相同體積抗體下，更小的膜可以使抗原和抗體孵育更充分。 回收的一抗可加入疊氮鈉抑菌（-20°保存影響不大）。 二抗作用時間不可太長，2小時之后已無抗原抗體結(jié)合，導(dǎo)致背景過深。9、 洗膜1、在搖床上用TBST洗膜3×5min 10、 顯影1、 打開電源，預(yù)冷成像系統(tǒng)，同時開機，打開GE成像軟件，等待顯示camera ready。2、 暗室紅燈下操作，按E

6、P管中加顯色劑A、B（4保存）按1：1劑量混勻，ECL發(fā)光液現(xiàn)配現(xiàn)用。  3、 用濾紙吸干PVDF膜上的TBST洗滌液。4、 平整鋪上保鮮膜，5、 將配好的ECL發(fā)光液均勻的涂布于PVDF蛋白膜上，蓋上另一半保鮮膜，放上合適大小的膠片，保鮮膜平整趕走氣泡，關(guān)閉成像儀蓋子，開始曝光。6、 曝光時間：根據(jù)需要，可先曝10-30s，視首曝決定是否再曝，或曝光時間。7、 曝光后可對圖像進行調(diào)節(jié)，通過調(diào)試背景亮度及曝光度。 顯色后strippingStripping solution: 100 mM 2-mercaptoethanol, 2% (w/v) SDS, 62.5 mM T

7、ris-HCl, pH 6.7 方法：將用過的膜浸入stripping buffer中，置50水浴箱中30min，間斷振搖。之后用TBST洗4*5min就好。 此時你已經(jīng)可以按新的轉(zhuǎn)移好的膜來再次使用了。 該方法的優(yōu)點：省事，省力，省錢。 11、 常見問題聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，聚合過程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有兩種：化學(xué)聚合法（常用）和光聚合法。PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。連續(xù)系統(tǒng)電泳：體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同；帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。不連續(xù)系統(tǒng)：由于緩沖液離子成分、p

8、H、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性；帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率比連續(xù)系統(tǒng)電泳的較好。不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC1。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9 Tris-HC1。電極緩沖液是pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。SDS-PAGE各試劑作用1. 過硫酸銨（APS）為催化劑2. 四甲基乙二胺

9、（TEMED）為加速劑：在聚合過程中，TEMED催化過硫酸銨產(chǎn)生自由基，后者引發(fā)丙烯酰胺單體聚合，同時甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產(chǎn)生甲叉鍵交聯(lián)，從而形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)3. SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結(jié)構(gòu)。4. 強還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和SDS結(jié)合成蛋白- SDS膠束，所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。5. 聚丙烯酰胺為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直

10、接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；制膠緩沖液選擇trisHCL系統(tǒng)；AP提供自由基；TEMED催化劑，催化自由基引起的聚合反應(yīng)進行；十二烷基硫酸鈉（SDS）陽離子去污劑，作用：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。 配膠緩沖液系統(tǒng)對電泳的影響？在SDSPAGE不連續(xù)電泳中，制膠緩沖液使用的是TrisHCl緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是pH6.7，分離膠pH8.9；而電泳緩沖液使用的Tris甘氨酸緩沖系統(tǒng)。在濃縮膠中，其pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場的作用下，泳動效率低；而Cl離子卻很高，兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動

11、。由于導(dǎo)電性與電場強度成反比，這一區(qū)帶便形成了較高的電壓梯度，壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品進入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時由于分離膠孔徑的縮小，在電場的作用下，蛋白分子根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進行分離。所以，pH對整個反應(yīng)體系的影響是至關(guān)重要的，實驗中在排除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況，應(yīng)首要考慮該因素，當(dāng)然其他的因素也可以從多方面考慮。 樣品如何處理？根據(jù)樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。1）還原SDS處理：在上樣buffe

12、r中加入SDS和DTT（或-巰基乙醇）后，蛋白質(zhì)構(gòu)象被解離，電荷被中和，形成SDS與蛋白相結(jié)合的分子，在電泳中，只根據(jù)分子量來分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當(dāng)濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min，再離心加樣。2）帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經(jīng)久牢固的保護SH基團，得到較窄的譜帶；另碘乙酸胺可捕集過量的DTT，而防止銀染時的紋理現(xiàn)象。100ul樣品緩沖液中10ul 20%的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。3）非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測定

13、分子量來使用。 SDS-PAGE電泳凝膠中各主要成分的作用？聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.8，分離膠選擇pH8.8，選擇TrisHCl系統(tǒng)，TEMED與AP：AP 催化劑，催化單丙和雙丙聚合成聚丙烯酰胺。TEMED四甲基乙二胺，催凝劑，加速AP催化作用；十二烷基磺酸鈉（SDS）：陰離子去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。 提高SDS-PAGE電泳分辨率的途徑？聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，

14、可在室溫下放置一段時間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導(dǎo)致凝固不充分，后者可導(dǎo)致SDS結(jié)晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法，具體可參照郭堯君編著的蛋白質(zhì)電泳技術(shù)手冊P82-103?！?微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現(xiàn)于較厚的凝膠中。處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實驗。 “皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。 為什么帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)

15、象？主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。處理辦法：加樣前離心；選擇適當(dāng)?shù)臉悠肪彌_液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時間過長，重新配制；降低凝膠濃度。 為什么帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象？主要是樣品不溶性顆粒引起的。處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。 什么是“鬼帶”，如何處理？“鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時，常會出現(xiàn)在泳道頂端（有時在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標(biāo)條帶大，有時不能進入分離膠。但它卻于目標(biāo)條帶有相同的免疫學(xué)活性，在WB反

16、應(yīng)中可見其能與目標(biāo)條帶對應(yīng)的抗體作用。處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補充不足的還原劑；或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。 為什么溴酚藍不能起到指示作用？我們在實驗中常會遇到溴酚藍已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來的現(xiàn)象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。處理辦法：更換正確pH值的Buffer；降低分離膠的濃度。 為什么電泳的條帶很粗？電泳中條帶很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原因。處理辦法：適當(dāng)增加濃縮膠的長度；保證濃縮膠貯液的pH正確(6.7）；適當(dāng)降低電壓； 為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢？這種現(xiàn)象一般初學(xué)者易出現(xiàn)。比如電壓50v以上，可電流卻在5mA以

17、下。主要是由于電泳槽沒有正確裝配，電流未形成通路。包括：a.內(nèi)外槽裝反；b.外槽液過少；c.電泳槽底部的絕緣體未去掉（比如倒膠用的橡膠皮）。處理辦法：電泳槽正確裝配即可。 濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對電泳有影響嗎？這主要出現(xiàn)在初學(xué)者中，一般對電泳不會有太大的影響。前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過猛所致；后者是由于在解除制膠的夾子后，板未壓緊而致空氣進入引起的。 凝膠時間不對，或慢或快，怎么回事？通常膠在30MIN-1H內(nèi)凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS劑量不夠或者失效。APS應(yīng)該現(xiàn)配現(xiàn)用，TEMED不穩(wěn)定，易被氧化成黃色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量過多，此時膠太

18、硬易裂，電泳時易燒膠。 電泳時間比正常要長？可能由于凝膠緩沖系統(tǒng)和電級緩沖系統(tǒng)地PH選擇錯誤，即緩沖系統(tǒng)地PH和被分離物質(zhì)的等電點差別太小，或緩沖系統(tǒng)的離子強度太高。分離膠加上后為什么要立即加水？加入分離膠后，立即覆一層雙蒸水，一是為了使分離膠界面保持水平，用水就可以把它壓平，使蛋白質(zhì)分子跑時在同一水平線上；二是阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用。連續(xù)分離膠體系配制（凝膠板厚度0.75mm，長度10cm）100ml體系：雙蒸水37.5ml尿 素20-50g10×TBE緩沖液8ml30%丙烯酰胺10mlAPS（過硫酸銨）500-800ul 注：現(xiàn)配現(xiàn)用TEMED（四甲基乙二胺） 23

19、.5ulSDSPAGE電泳的原理及濃縮膠濃縮樣品的原理（甘氨酸的作用） SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）是目前最常用的分離蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。下面就SDS-PAGE的基本原理做簡單介紹。 SDSPAGE電泳的基本原理？ SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進SDS， SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，強還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強還原劑的SDS溶液中， 與SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的SDS，使蛋白

20、質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為 特征的負(fù)離子團塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在進行電泳時，蛋白質(zhì)分子的遷移 速度取決于分子大小。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分 子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進行電泳，根據(jù)它 的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。 SDS-PAGE電泳成

21、功的關(guān)鍵是什么？ 溶液中SDS單體的濃度  SDS在水溶液中是以單體和SDS-多肽膠束的混合形式存在，能與蛋白質(zhì)分子結(jié)合的是單體。為了保證蛋白質(zhì)與SDS的充分結(jié)合，它們的重量比應(yīng)該為14 或13。 樣品緩沖液的離子強度  因為SDS結(jié)合到蛋白質(zhì)上的量僅僅取決于平衡時SDS單體的濃度，不是總濃度，而只有在低離子強度的溶液中，SDS單體才具有較高的平衡濃度。所 以，SDS電泳的樣品緩沖液離子強度較低，常為10-100 mM。 二硫鍵是否完全被還原  只有二硫鍵被完全還原以后，蛋白

22、質(zhì)分子才能被解聚，SDS才能定量地結(jié)合到亞基上從而給出相對遷移率和分子質(zhì)量對數(shù)的線性關(guān)系。Sample buffer中的-巰基乙醇的濃度常為4-5%，二硫蘇糖醇的濃度常為2-3%。前者有揮發(fā)性，最好使用前加入。 SDS-PAGE緩沖液系統(tǒng)的選擇，Tris-Glycine、Tris-Tricine、Tris-硼酸鹽或者其他？ 一般來說，在被分析的蛋白質(zhì)穩(wěn)定的pH范圍，凡是不與SDS發(fā)生相互作用的緩沖液都可以使用，但緩沖液的選擇對蛋白帶的分離和電泳的速度是非常關(guān)鍵 的。Tris-甘氨酸系統(tǒng)是目前使用最多的緩沖系統(tǒng)。如果要測定糖蛋白的分子量，最好采用Tris-

23、硼酸鹽緩沖系統(tǒng)，對于分子質(zhì)量小于15 kDa的蛋白樣品，可以使用SDS-尿素系統(tǒng)，也可以采用Tris-tricine緩沖系統(tǒng)。 積層膠（或稱濃縮膠）的作用原理？ 在緩沖系統(tǒng)中的弱酸，如甘氨酸，在pH6.7時很少解離，其有效泳動速率很低，而氯離子卻有很高的泳動速率，蛋白質(zhì)的泳動速率介于兩者之間。加上電 壓以后，作為先導(dǎo)離子的氯離子和尾隨離子的甘氨酸離子分離開來，并在其后面留下一個導(dǎo)電性較低的區(qū)帶。由于導(dǎo)電性和電場強度成反比，這一區(qū)帶便獲得較高的 電壓梯度，加速甘氨酸離子的泳動，使其趕上氯離子，建立起甘氨酸和氯離子的電壓梯度和泳動速率乘積相等的穩(wěn)定

24、態(tài)（我不太明白這句話），使這些帶電顆粒以相 同的速度泳動，兩種離子之間有明顯的邊界。當(dāng)甘氨酸、氯離子界面通過樣品進入濃縮膠時，在移動界面前有一低電壓梯度，界面后有一高電壓梯度。由于在移動界 面前的蛋白質(zhì)分子泳動速率比氯離子低，因此氯離子能迅速越過。移動界面后的蛋白質(zhì)處于較高的電壓梯度中，其泳動速率比甘氨酸快。因此，移動的界面將蛋白質(zhì) 分子堆積到一起，形成一條狹窄的區(qū)帶。蛋白質(zhì)在移動界面中的濃度作用僅取決于樣品和濃縮膠中Tris-HCl的濃度（為什么？），而與樣品中蛋白質(zhì)的最初 濃度無關(guān)。由于濃縮膠為大孔凝膠，故對蛋白樣品沒有分子篩作用。當(dāng)移動的界面到達濃

25、縮膠和分離膠的界面時，凝膠的pH明顯增加，導(dǎo)致甘氨酸大量解離。此 時，甘氨酸的有效泳動速率明顯增加，超越蛋白分子，直接在氯離子后移動。由于凝膠孔徑變小，蛋白質(zhì)分子的遷移速率降低，落在后面的蛋白質(zhì)便在均一的電壓梯 度和pH環(huán)境中泳動，并根據(jù)其固有的電荷與分子大小進行分離。 可見，甘氨酸并非作為緩沖成分參與，而是作為尾隨離子來參與電泳過程。 以上內(nèi)容主要摘自蛋白質(zhì)電泳實驗技術(shù)第二版（郭堯君編著)。需要進一步了解相關(guān)內(nèi)容的同學(xué)可以查閱該書。   SDS-page電泳小問答     

26、       Q：SDSPAGE電泳的基本原理？    A：SDS-聚丙烯酰胺 凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進SDS（十二烷基硫酸鈉）， SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，強還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強還原劑的SDS溶液中， 與SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為 特征的負(fù)離子

27、團塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在進行電泳時，蛋白質(zhì)分子的遷移 速度取決于分子大小。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分 子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進行電泳，根據(jù)它 的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。       Q：配膠緩沖液系統(tǒng)對

28、電泳的影響？    A：在SDSPAGE不連續(xù)電 泳中，制膠緩沖液使用的是TrisHCL緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是pH6.7，分離膠pH8.9；而電泳緩沖液使用的Tris甘氨酸緩沖系統(tǒng)。在濃縮膠中， 其pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場的作用下，泳動效率低；而CL離子卻很高，兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳 動。由于導(dǎo)電性與電場強度成反比，這一區(qū)帶便形成了較高的電壓剃度，壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品進入分離膠后，由于膠中pH的 增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動速率

29、增加，直接緊隨氯離子之后，同時由于分離膠孔徑的縮小，在電場的作用下，蛋白分子根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進 行分離。    所以，pH對整個反應(yīng)體系的影響是至關(guān)重要的，實驗中在排除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況，應(yīng)首要考慮該因素。       Q：樣品如何處理？    A：根據(jù)樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。    &#

30、160;1、還原SDS處理：在還原劑中加入SDS和DTT（或Beta巰基乙醇）后，蛋白質(zhì)構(gòu)象被解離，電荷被中和，形成SDS與蛋白相結(jié)合的分子，在電泳 中，只根據(jù)分子量來分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當(dāng)濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min，再離心加樣。    2、帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經(jīng)久牢固的保護SH基團，得到較窄的譜帶；另碘乙酸胺可捕集過量的DTT，而防止銀染時的紋理現(xiàn)象。100ul樣品緩沖液中10ul 20的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。  

31、  3、非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1SDS沸水中煮3min，未加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測定分子量來使用。       Q：SDS-PAGE電泳凝膠中各主要成分的作用？    A:聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；    制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9，選擇trisHCL系統(tǒng)，具體作用后

32、面介紹；    TEMED與AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；    十二烷基硫酸鈉（SDS）：陽離子去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。    Q：提高SDS-PAGE電泳分辨率的途徑？    A：1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導(dǎo)致凝固不充分，后者可導(dǎo)致SDS結(jié)晶。一般凝

33、膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。    2、一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法，具體可參照郭堯君編著的蛋白質(zhì)電泳技術(shù)手冊P82-103。       Q：“微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？    A：主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現(xiàn)于較厚的凝膠中。    處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實驗。   

34、0;   Q：“皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？    A：主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。    處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。       Q：為什么帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象？    A：主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。    處理辦法：加樣前離心；選擇適當(dāng)?shù)臉悠肪彌_液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時間過長，重新配制；降低凝膠濃度。       Q：為什么帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象？    A：主要是樣品不溶性顆粒引起的。    處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。 &