優(yōu)選生精湯中淫羊藿苷的提取工藝論文響應(yīng)面分析法優(yōu)選生精湯中淫

1、優(yōu)選生精湯中淫羊藿苷的提取工藝論文：響應(yīng)面分析法優(yōu)選生精湯中淫羊藿苷的提取工藝研究【摘要】  目的優(yōu)選生精湯中淫羊藿苷提取的工藝條件。方法采用響應(yīng)面分析法，以提取物淫羊藿苷含量為指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間等因素對(duì)提取工藝的影響。結(jié)果優(yōu)選出醇提淫羊藿苷的最佳工藝為：加30倍量70乙醇，回流提取1.75 h，提取兩次。生精湯中淫羊藿苷的含量為1.36 g/g。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便易行，穩(wěn)定性好，適于工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用?！娟P(guān)鍵詞】  響應(yīng)面分析法； 淫羊藿苷； 提取工藝； Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)生精湯由菟絲子、淫羊藿、熟地、補(bǔ)骨脂、女貞子等11味中藥組成。

2、經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1證明生精湯能顯著降低模型大鼠血清雄激素含量，增加血清雌、孕激素含量促排卵。經(jīng)多年臨床應(yīng)用2證實(shí)的生精湯為中醫(yī)藥補(bǔ)腎活血法治療女性多囊卵巢綜合征的有效組方。淫羊藿為處方中的君藥，淫羊藿苷類黃酮化合物為其主要有效成分，此外含有生物堿、木脂素、多糖和微量元素等。現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究表明3，4，淫羊藿總黃酮具有性激素樣作用，可以使雌性小鼠子宮增重、E2含量升高、雄性小鼠血清T含量升高。淫羊藿苷能延緩卵巢卵母細(xì)胞巢破裂，抑制原始卵泡的發(fā)育啟動(dòng)，減少卵泡的消耗，使處于靜止期的原始卵泡數(shù)增多5。淫羊藿總黃酮為生精湯治療女性多囊卵巢綜合征的主要有效成分之一。響應(yīng)面分析法6以回歸方法作為函數(shù)估算的工具，

3、將多因子試驗(yàn)中因子與試驗(yàn)結(jié)果的相互關(guān)系函數(shù)化，可研究因子與響應(yīng)值之間、因子與因子之間的相互關(guān)系，并可進(jìn)行優(yōu)化。本文采用響應(yīng)面分析法，以提取物淫羊藿苷含量為指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察藥材的料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間等因素對(duì)提取工藝的影響，優(yōu)選淫羊藿苷的最佳提取工藝，以便提出更多的有效成分，提高治療效果。1  儀器與試藥1.1  儀器LC-10AD高效液相色譜儀（日本島津公司），CLASS-VP色譜工作站，GL-CQ-250S超聲波清洗機(jī)（上海杰理科技有限公司），AE-240電子天平(上海梅特勒一托利多儀器有限公司)。W一201B數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海申騰生物技術(shù)有限公司)，R-201旋

4、轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (上海申勝生物技術(shù)有限公司)。1.2 材料與試劑生精湯中各藥材（菟絲子、淫羊藿、熟地、補(bǔ)骨脂、女貞子、山藥、雞血藤、劉寄奴、王不留行、制香附、生麥芽）購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)飲片廠，并經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)姚振生教授鑒定。     淫羊藿苷對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110737-200312，乙腈、甲醇(供高效液相色譜測(cè)定用)為色譜純，超純水，其余為分析純。2   方法與結(jié)果2.1  淫羊藿苷的含量測(cè)定7  色譜條件色譜柱為phenomenex-Genmini-C18(4.6 mm×

5、150 mm)；流動(dòng)相為甲醇水（5248）；流速1.0 ml·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm；柱溫30；檢測(cè)靈敏度0.02AUFS；進(jìn)樣量20 l。  對(duì)照品溶液的制備精密稱取淫羊藿苷對(duì)照品2 mg，置10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每毫升含有0.24 mg淫羊藿苷的溶液，作為對(duì)照品溶液。  供試品溶液的制備按處方取生精湯各味藥材，精密稱定，回流提取兩次，合并提取液，混勻，濃縮至100 ml，取1 ml用0.45 m微孔濾膜過(guò)濾，作為供試品溶液。  標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取對(duì)照品溶液，倍半稀釋后，分別注入液相色譜儀，記錄淫羊藿苷峰的

6、峰面積。以進(jìn)樣濃度C(g/g)為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：A=2×106C+109 929，r=0.999 9。表明淫羊藿苷在4.80.15 g范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。 精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取濃度為0.2 g/l的對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，每次20 l，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD=0.28%，表明儀器精密度良好。   加樣回收實(shí)驗(yàn)取已知含量的生精膠囊樣品0.25 g，共5份，分別加入0.2 g/l的淫羊藿苷對(duì)照品10 l，其余同“”供試品溶液的制備方法制備，按“”色譜條件進(jìn)樣20 l，測(cè)定峰面積，并計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為100.4%，RSD=2

7、.5%，表明本方法具有較好的加樣回收率。2.2  淫羊藿苷提取工藝研究2.2.1 響應(yīng)面分析法因素的選取及方案分析按照處方分別稱取生精湯各藥材，共20.4 g，根據(jù)Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理6，綜合單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取料液比、提取時(shí)間、乙醇濃度3個(gè)因素，每個(gè)自變量的低、中、高水平分別以-1，0，1編碼，以淫羊藿苷得率作為響應(yīng)值（Y）。采用SAS對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析。試驗(yàn)因素與水平見表1，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。表2  實(shí)驗(yàn)因素與水平（略）表2  響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果（略）   回歸方程顯著性及方差分析（略）由表3可知，在置信

8、區(qū)間95%時(shí)，方程線性相關(guān)系數(shù)R= 0.989 1。證明回歸方程真實(shí)、可靠，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可用于替代實(shí)驗(yàn)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。方程各自變量(Xn)方差分析表明，方程一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和交互項(xiàng)對(duì)多糖提取得率具有顯著性影響，因此各因素與響應(yīng)值之間不是簡(jiǎn)單的一次關(guān)系。并進(jìn)一步對(duì)回歸方程各項(xiàng)作顯著性檢驗(yàn)。表4  回歸方程各項(xiàng)的顯著性檢驗(yàn)分析（略）由表可知，液料比對(duì)淫羊藿苷提取得率具有顯著性影響，而提取時(shí)間、醇濃度則無(wú)顯著性影響。根據(jù)回歸分析結(jié)果作出相應(yīng)曲面圖和等值線圖，見圖13。利用SAS軟件，進(jìn)行分析計(jì)算，得淫羊藿苷的最佳提取工藝條件為：液料比29.71，提取時(shí)間1.78 h，乙醇濃度71.

9、8%，在此條件下淫羊藿苷的理論提取得率為1.14 g/g。結(jié)合實(shí)際操作方便和方差分析結(jié)果，確定最佳提取工藝條件為：加藥材30倍量的70%的乙醇提取1.75 h，共提取兩次。   驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)按照最佳提取工藝進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，提取3次，測(cè)得淫羊藿苷的平均得率為1.36 g/g，RSD為3.51%。結(jié)果見表5。表明該工藝穩(wěn)定可行，重復(fù)性好。表5  驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果（略）3   討論     本研究采用響應(yīng)面分析法對(duì)淫羊藿苷提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并得到回歸方程。其最佳提取工藝條件為：加藥材30倍量的70%乙醇提取

10、兩次，每次1.75h，結(jié)果淫羊藿苷得率為1.36 g/g。    傳統(tǒng)的數(shù)理統(tǒng)計(jì)往往采用正交設(shè)計(jì)或均勻設(shè)計(jì)8，尋求最佳的因素水平組合，但不能在給出的整個(gè)區(qū)域上找到因素和響應(yīng)值之間的一個(gè)明確的函數(shù)表達(dá)式，從而無(wú)法找到整個(gè)區(qū)域上的因素的最佳組合和響應(yīng)的最優(yōu)值。響應(yīng)面分析法是通過(guò)中心組合實(shí)驗(yàn)研究幾種實(shí)驗(yàn)因素間相互作用的一種回歸分析方法，具有周期短，實(shí)驗(yàn)次數(shù)少，回歸方程精確度高等優(yōu)點(diǎn)，并能從圖形方面分析尋求最優(yōu)實(shí)驗(yàn)考察因素。本實(shí)驗(yàn)利用響應(yīng)面分析法所得淫羊藿苷提取最佳工藝，具有操作方便、重復(fù)性好、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)，穩(wěn)定可行?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1周 璐，章巧

11、萍，徐孝平，等生精湯對(duì)雄激素致無(wú)排卵模型大鼠卵巢功能及形態(tài)學(xué)的影響J浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，30（6）：6212章巧萍淺談補(bǔ)腎活血法治療多囊卵巢綜合征J中醫(yī)藥信息雜志，2004，11(11)：10143黃 菊，羅麗莉，傅玉才，等淫羊藿甙對(duì)大鼠早期卵巢卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞凋亡影響的初步研究J中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2007，17（5）：5234劉 娟，朱兆榮，汪江華，等淫羊藿、補(bǔ)骨脂及其復(fù)方提取液的性激素樣作用觀察J中國(guó)獸醫(yī)雜志，2003，39(6) ：33 5葉海涌，劉 健，樓宜嘉淫羊藿苷衍生物的制備及其雌激素樣作用研究J浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2005，34(2)：1316Carlson R·Designs forExplorative E