幾種中藥有效成分對脂肪細(xì)胞胰島素增敏作用的研究

1、幾種中藥有效成分對脂肪細(xì)胞胰島素增敏作用的研究    【摘要】 1.研究益氣散聚方中藥有效成分黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮等對胰島素抵抗的脂肪細(xì)胞模型糖脂代謝的影響,以了解這些有效成分有無改善胰島素抵抗的作用。2.研究黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮等中藥有效成分對前脂肪分化的作用以及對分化過程中的相關(guān)基因過氧化物酶體增殖物激活受體（PeroxisomeProliferator Activated Receptor,PPAR）和CAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（CAAT/Enhancer Binding Protein,C/EBP）mRNA表達(dá)的影響。并與TZD藥物

2、的作用機(jī)制進(jìn)行比較。3.在研究中藥有效成分對胰島素增敏作用的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步觀察其對胰島素抵抗模型細(xì)胞胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用及相關(guān)細(xì)胞因子分泌的影響,探討它們影響胰島素敏感性的可能作用機(jī)制。4.以藥測證,探討胰島素抵抗的中醫(yī)病機(jī)特點(diǎn)及治療原則。方法1.幾種中藥有效成分對胰島素抵抗脂肪細(xì)胞糖脂代謝的影響胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型的建立與鑒定:將24孔培養(yǎng)板中分化成熟的脂肪細(xì)胞以含1%BSA的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12h后分為正常葡萄糖正常胰島素組及高糖高胰島素組,每組7個樣本。干預(yù)培養(yǎng)24 h后,通過3H-脫氧葡萄糖的攝取試驗(yàn)測定兩組脂肪細(xì)胞對葡萄糖的攝取情況。葡萄糖消耗試驗(yàn)檢測中藥有效成分對正常3

3、T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖的消耗及細(xì)胞活性的影響:實(shí)驗(yàn)設(shè)對照組、各中藥有效成分組（黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮）及羅格列酮組。每種中藥有效成分和羅格列酮分別采用五個濃度。干預(yù)培養(yǎng)24 h,以葡萄糖氧化酶法檢測每孔培養(yǎng)液中葡萄糖的含量,與未接種細(xì)胞的空白孔的糖含量均值相減,計(jì)算葡萄糖的消耗。葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)結(jié)束后移出培養(yǎng)液,二甲氧唑黃比色法（XTT）檢測細(xì)胞活力。并結(jié)合葡萄糖消耗及XTT檢測結(jié)果確定藥物的最適濃度。3H-脫氧葡萄糖攝取試驗(yàn)檢測中藥有效成分對胰島素抵抗模型脂肪細(xì)胞對葡萄糖攝取能力的影響:實(shí)驗(yàn)設(shè)對照組、模型組、中藥有效成分組（黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮）及羅格列酮組,干預(yù)培養(yǎng)24 h后

4、,在基礎(chǔ)狀態(tài)及胰島素刺激狀態(tài)下通過3H-脫氧葡萄糖的攝取試驗(yàn)測定各中藥有效成分對脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取的影響。比色法檢測中藥有效成分對胰島素抵抗模型脂肪細(xì)胞游離脂肪酸（FreeFatty Acid,FFA）溢出的影響:實(shí)驗(yàn)設(shè)對照組、模型組、中藥有效成分組（黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮）及羅格列酮組,干預(yù)培養(yǎng)24 h后,收集細(xì)胞上清液,通過比色法檢測各組FFA溢出情況。2.幾種中藥有效成分對3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響中藥有效成分對3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響:實(shí)驗(yàn)設(shè)對照組、中藥有效成分組（黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮）及羅格列酮組,在誘導(dǎo)分化的同時(shí)加藥,藥物與分化液同步更換。分化第8天進(jìn)行

5、油紅O染色,拍攝照片。異丙醇處理染色細(xì)胞,570 nm波長檢測OD570值。不同中藥有效成分對3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)的影響:實(shí)驗(yàn)設(shè)對照組、中藥有效成分組（黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮）及羅格列酮組,在誘導(dǎo)分化的同時(shí)加藥,藥物與培養(yǎng)液同步更換。分化第8天抽提細(xì)胞總RNA,通過實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶聯(lián)反應(yīng)（Realtime- Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）分析脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）和CAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（C/EBP）的mRNA表達(dá)。3.幾種中藥有效成分對胰島素抵抗脂肪細(xì)胞胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及脂肪細(xì)胞因子溢出的

6、影響3H-脫氧葡萄糖的攝取試驗(yàn)檢測PI-3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路阻滯劑Wortmannnin干預(yù)下中藥有效成分對胰島素抵抗模型脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取的影響:實(shí)驗(yàn)設(shè)對照組、模型組、中藥有效成分組（黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮）及羅格列酮組,Wortmannin干預(yù)30min后,各藥物干預(yù)培養(yǎng)24 h,通過3H-脫氧葡萄糖的攝取試驗(yàn)測定各組脂肪細(xì)胞對葡萄糖的攝取情況。Western blot方法檢測中藥有效成分對胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵蛋白磷酸化表達(dá)的影響:實(shí)驗(yàn)設(shè)對照組、模型組、中藥有效成分組（黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮）及羅格列酮組,干預(yù)培養(yǎng)24 h后,收集細(xì)胞,提取全細(xì)胞蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

7、后,通過Western blot方法檢測各組酪氨酸磷酸化胰島素受體、絲氨酸磷酸化Akt及酪氨酸磷酸化c-Cbl的蛋白表達(dá)量。4.ELISA法檢測中藥有效成分對Resistin,TNF等脂肪因子分泌的影響實(shí)驗(yàn)設(shè)對照組、模型組、中藥有效成分組（黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮）及羅格列酮組,干預(yù)培養(yǎng)24 h后,收集細(xì)胞上清液。ELISA法測定各組脂肪細(xì)胞Resistin及TNF蛋白分泌的情況。結(jié)果1.幾種中藥有效成分對胰島素抵抗脂肪細(xì)胞糖代謝的影響胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型的建立與鑒定:以正常葡萄糖正常胰島素組作為葡萄糖攝取的正?；?高糖高胰島素組可以使葡萄糖的攝取率下降59.5%。葡萄糖消耗試驗(yàn)及XT

8、T試驗(yàn)檢測中藥有效成分對正常3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖的消耗及細(xì)胞活力的影響:各中藥有效成分在適當(dāng)?shù)臐舛染娠@著增加正常3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖的消耗,黃芪多糖濃度為0.4 g/L時(shí)細(xì)胞葡萄糖消耗量最大,比對照組增加11%（P0.01）;小檗堿濃度為40mol/L時(shí)細(xì)胞葡萄糖消耗量達(dá)到最大,比對照組增加20%（P0.01）;蒲黃總黃酮濃度為0.2g/L時(shí)葡萄糖消耗量最大,比對照組增加27%（P0.01）。XTT檢測結(jié)果顯示,黃芪多糖濃度從0.05 g/L到0.4g/L對細(xì)胞活力無明顯影響:小檗堿濃度超過10mol/L時(shí),XTT值顯著降低,濃度在5mol/L以下時(shí)對細(xì)胞活力影響不大。蒲黃總黃酮

9、濃度從0.05g/L到0.4g/L時(shí),對脂肪細(xì)胞活力無明顯影響。結(jié)合葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)及XTT檢測結(jié)果,每種藥物選取一種最適濃度,分別為:黃芪多糖0.4 g/L、小檗堿5mol/L、蒲黃總黃酮0.2g/L、羅格列酮5mol/L,在最適濃度下各中藥有效成分均可促進(jìn)正常3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗（與對照組比較P0.01）;且對細(xì)胞活力無明顯影響。3H-脫氧葡萄糖攝取試驗(yàn)檢測中藥有效成分對基礎(chǔ)狀態(tài)下胰島素抵抗脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取的影響:3T3-L1脂肪細(xì)胞經(jīng)高糖和高胰島素聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)可建立胰島素抵抗的細(xì)胞模型。以模型組（MOD）細(xì)胞葡萄糖攝取量作為基值（100%）,各組葡萄糖攝取量分別與之相比作為各自

10、葡萄糖攝取率。在基礎(chǔ)狀態(tài)下,MOD組攝取率比對照組（CON）減少了46.8%。不同中藥有效成分干預(yù)培養(yǎng)24h后,黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮在無胰島素刺激的基礎(chǔ)狀態(tài)下均可促進(jìn)模型細(xì)胞的葡萄糖攝取。其中,APS組的葡萄糖攝取率最高,為MOD的309.8%（P0.01）,BER組和PTF組分別為MOD組的207.6%（P0.05）和298.3%（P0.01）。ROS組為MOD組的385.0%（P0.01）3H-脫氧葡萄糖攝取試驗(yàn)檢測幾種中藥有效成分在胰島素刺激狀態(tài)下對胰島素抵抗脂肪細(xì)胞葡萄糖的攝取影響:以MOD組葡萄糖攝取量作為基值（100%）,各組葡萄糖攝取量分別與之相比作為各自葡萄糖攝取率。在

11、胰島素刺激下,MOD組葡萄糖攝取比CON減少了59.5%。不同中藥有效成分干預(yù)培養(yǎng)24h后,黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮在胰島素刺激狀態(tài)下均可促進(jìn)模型細(xì)胞的葡萄糖攝取。其中,小檗堿組的葡萄糖攝取率最大,為MOD的144.8%（P0.01）,黃芪多糖和蒲黃總黃酮組分別為MOD組的126.8%（P0.01）和121.7%（P0.01）。羅格列酮組為MOD的194.9%（P0.01）中藥有效成分對3T3-L1脂肪細(xì)胞FFA溢出的影響經(jīng)高糖高胰島素培養(yǎng),MOD組FFA溢出與CON組相比有明顯上升,增加了17.5%。經(jīng)不同中藥有效成分干預(yù)后,細(xì)胞上清液的FFA濃度均有不同程度的下降,黃芪多糖、小檗堿、蒲

12、黃總黃酮及羅格列酮組FFA溢出分別比MOD組減少了8.7%、7.1%、16.4%及9.7%（P0.01或P0.05）。2.幾種中藥有效成分對3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化及相關(guān)基因表達(dá)的影響中藥有效成分對3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響:黃芪多糖、蒲黃總黃酮及羅格列酮均明顯促進(jìn)細(xì)胞的分化（與對照組比較,P0.01）;小檗堿明顯抑制脂肪細(xì)胞的分化（與對照組比較,P0.01）。各中藥有效成分組分化程度均低于羅格列酮組（與羅格列同組比較,P0.01）。中藥有效成分對3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)的影響:黃芪多糖及蒲黃總黃酮明顯促進(jìn)脂肪細(xì)胞PPARmRNA的表達(dá)（P0.01）;而小檗堿組PPARm

13、RNA的表達(dá)量顯著低于對照組（P0.01）。黃芪多糖組及蒲黃總黃酮組C/BPmRNA表達(dá)量比對照組明顯上調(diào)（P0.01）;而小檗堿顯著抑制C/EBPmRNA的表達(dá)（與對照組比較,均P0.01）。各中藥有效成分組PPAR及C/EBP的mRNA表達(dá)量均低于羅格列酮組（P0.01）。3.幾種中藥有效成分對胰島素抵抗脂肪細(xì)胞胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及脂肪細(xì)胞因子溢出的影響3H-脫氧葡萄糖的攝取試驗(yàn)檢測PI-3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路阻滯劑Wortmannnin干預(yù)下中藥有效成分對胰島素抵抗模型脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取的影響:加入Wortmannin干預(yù)后,MOD組葡萄糖攝取率比同樣接受Wortmannin作用的CON組下降

14、了47.8%,黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮及羅格列酮干預(yù)模型細(xì)胞后,葡萄糖攝取比MOD組分別增加了86.8%、190.8%、187.4%和201.1%。在各實(shí)驗(yàn)組加與不加Wortmannin的自身比較中,CON、MOD、黃芪多糖和羅格列酮組加Wortmannin后的葡萄糖攝取率比不加Wortmannin時(shí)均有降低,分別為不加Wortmannin時(shí)的60.3%、45.6%、78.3%和76.9%。而小檗堿及蒲黃總黃酮組Wortmannin干預(yù)前后的葡萄糖攝取率并未有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Westernblot方法檢測中藥有效成分對胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化表達(dá)的影響:以MOD組InsR B蛋白酪氨

15、酸磷酸化表達(dá)量作為基值,各組與之相比計(jì)算InsR磷酸化表達(dá)的相對定量。胰島素抵抗模型細(xì)胞比較與正常細(xì)胞相比InsR B磷酸化表達(dá)有顯著下調(diào)（P0.01）;與MOD組比較,各中藥有效成分及羅格列酮組均使胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型InsR酪氨酸磷酸化表達(dá)顯著上調(diào)（P0.01）。以MOD組絲氨酸磷酸化Akt蛋白表達(dá)量作為基值,各組與之相比計(jì)算磷酸化Akt蛋白表達(dá)的相對定量。MOD組絲氨酸磷酸化Akt蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P0.01）;各中藥有效成分及ROS組均可不同程度的上調(diào)模型細(xì)胞Akt蛋白絲氨酸磷酸化水平,各組與MOD組比較均有顯著性差異（P0.01）。以MOD組酪氨酸磷酸化c-Cbl蛋白表達(dá)量作為基值

16、,各組與之相比計(jì)算磷酸化c-Cbl蛋白表達(dá)的相對定量。MOD組酪氨酸磷酸化c-Cbl蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P0.01）。各中藥有效成分及ROS組均可不同程度的上調(diào)模型細(xì)胞c-Cbl蛋白酪氨酸磷酸化水平,與MOD組比較均有顯著性差異（P0.01）。ELISA法檢測中藥有效成分對TNF、Resistin等脂肪細(xì)胞因子分泌的影響:與CON組相比,MOD組TNF的分泌有明顯上升,增加了57.6%。黃芪多糖及羅格列酮干預(yù)后,細(xì)胞培養(yǎng)液中的TNF濃度有不同程度的下降,分別比MOD組減少19.9%（P0.05）和17.4%（P0.01）。而小檗堿及蒲黃總黃酮組與MOD組相比TNF的水平未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。MOD組脂

17、肪細(xì)胞分泌Resistin的濃度與CON組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。黃芪多糖、蒲黃總黃酮及羅格列酮干預(yù)后,細(xì)胞培養(yǎng)液中的Resistin濃度有不同程度的下降,分別比MOD組減少了27.9%（P0.01）、13.7%（P0.05）和30.9（P0.01）。而小檗堿組與MOD組相比Resistin的水平未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論1、成熟脂肪細(xì)胞經(jīng)高糖高胰島素培養(yǎng)24h能明顯抑制其葡萄糖的攝取,可誘導(dǎo)建立胰島素抵抗細(xì)胞模型。適用于有關(guān)藥物篩選及機(jī)制研究。2、黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮等中藥有效成分可在對培養(yǎng)細(xì)胞基本無毒的安全濃度范圍內(nèi),在基礎(chǔ)及胰島素刺激狀態(tài)下不同程度增加脂肪細(xì)胞對胰島素的敏感性,改善胰島素抵抗

18、模型脂肪細(xì)胞的糖脂代謝。3、黃芪多糖及蒲黃總黃酮促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化,上調(diào)分化相關(guān)基因PPARmRNA的表達(dá),表現(xiàn)出類似PPAR激動劑的效應(yīng);小檗堿抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化,減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的積聚,下調(diào)脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因PPARmRNA和C/EBPmRNA的表達(dá),表現(xiàn)出類似PPAR抑制劑的效應(yīng)。中藥復(fù)方中不同成分的作用取向,體現(xiàn)了中藥作用的多靶點(diǎn)多途徑的特點(diǎn),為胰島素抵抗的防治提供新的思路,可以拓寬應(yīng)用中醫(yī)藥或中西醫(yī)結(jié)合方法防治胰島素抵抗的途徑。4、APS、BER、PTF可通過對胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響而改善胰島素抵抗。三種有效成分均可促進(jìn)胰島素刺激下胰島素受體B亞基酪氨酸磷酸