灰樹花多糖增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放射治療的敏感性及其分子機(jī)理初探

1、灰樹花多糖增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放射治療的敏感性及其分子機(jī)理初探<    作者：曹衛(wèi)國，蔣勁松，馬韜，趙勝光，韓白衣【摘要】 目的 探討灰樹花多糖對(duì)增強(qiáng)人腫瘤細(xì)胞放射治療敏感性的作用，研究灰樹花多糖與X-射線聯(lián)合使用后細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax的mRNA表達(dá)水平的變化并探討兩者協(xié)同作用的分子機(jī)理。方法 用CCK-8方法測(cè)定灰樹花多糖與X-射線聯(lián)合處理后HCT116的細(xì)胞存活率（cell survival rate，CSR）；用Apoptosis Ladder Detection Kit進(jìn)行灰樹花多糖與X-射線聯(lián)合處理后細(xì)胞凋亡檢測(cè)；用RT-PCR方法測(cè)定Bax

2、 基因的表達(dá)。結(jié)果 (1）灰樹花多糖與X-射線聯(lián)合處理對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接殺傷作用高于X-射線單獨(dú)處理；(2）X射線與灰樹花多糖聯(lián)合處理時(shí)細(xì)胞發(fā)生凋亡；(3）X-射線與灰樹花多糖聯(lián)合處理后細(xì)胞發(fā)生凋亡的分子機(jī)理與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax的表達(dá)提高相關(guān)。結(jié)論 灰樹花多糖對(duì)腫瘤放射治療具有明顯的增敏作用，聯(lián)合使用可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，此作用可能與凋亡相關(guān)基因Bax的表達(dá)增加相關(guān)。    【關(guān)鍵詞】 灰樹花多糖；X-射線；細(xì)胞凋亡；Bax    A Polysaccharide from Grifola frondosa Pro

3、motes X-ray induced cell apoptosis through upregulation of Bax in HCT116 cells    【Abstract】 Objective To explore the efficiency of the polysaccharide extracted from Grifola frondosa，in enhancing sensitivity to X-ray irradiation in human colon cancer cells HCT116. The levels of B

4、ax mRNA were investigated in the treatment of the polysaccharide extracted from Grifola frondosa combinated with X-ray treatment to demonstrate the molecular basis for the synergistic effects.Methods HCT116 cell survival rate were monitored by CCK-8 kit. Apoptosis was detected with Apoptosis Ladder

5、Detection Kit in the agarose gel electrophoresis. Bax gene expression was checked by semiquantitative PCR analysis of cellular RNA. Results Here we showed the sensitivity to X-irradiation was detected an increase in the combination of the polysaccharide extracted from Grifola frondosa and X-ray，comp

6、aring to X-ray alone. Moreover，the effect of the polysaccharide extracted from Grifola frondosa combined with X-ray on apoptosis was observed by DNA-ladder formation. We also present the evidence that pro-apoptotic gene Bax expresion may be involved in augmented the polysaccharide extracted from Gri

7、fola frondosa induced HCT116 cells sensitivity to X-ray irradiation.Conclusion The sensitivity to X-irradiation was increased in the combination of the polysaccharide from Grifola frondosa and X-ray. Moreover，the effect of the polysaccharide from Grifola frondosa combined with X-ray on apoptosis was

8、 observed and pro-apoptotic gene Bax expresion may be involved in augmented the polysaccharide extracted from Grifola frondosa induced HCT116 cells sensitivity to X-ray irradiation.    【Key words】 Grifola frondosa; X-ray; apoptosis;Bax    灰樹花（Grifola frondosa）

9、是一種生長在亞熱帶至溫帶的大型藥、食兼用珍稀食用菌，又名栗蘑、貝葉多孔菌等，在分類學(xué)上屬擔(dān)子菌綱多孔菌科，我國較早的權(quán)威專著中國的真菌稱其為“灰樹花”，日本稱之為“舞茸”，其口味鮮美、營養(yǎng)豐富，含有眾多活性物質(zhì)，灰樹花多糖就是最主要的一類活性成分。    灰樹花多糖除含有-1，6-支鏈-1，3-葡聚糖外還含有大量高度分支化的-1，3-支鏈-1，6-葡聚糖，研究表明，這種特定的結(jié)構(gòu)使其擁有更強(qiáng)的生物調(diào)節(jié)活性1。作為一種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑（BRM），灰樹花多糖具有增強(qiáng)免疫功能、抑制腫瘤等廣泛的生理活性2。    灰樹花多糖

10、具有明顯的抗腫瘤作用，能激活機(jī)體免疫細(xì)胞群如T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞，并可促進(jìn)多種細(xì)胞因子的分泌如IL-2、IL-8、IL-12、-INF、TNF-等，增強(qiáng)腫瘤局部免疫反應(yīng)，抑制腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移35。    放射治療對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用在一定程度上限制了對(duì)惡性腫瘤的治療作用，灰樹花多糖可以通過與放療的協(xié)同作用，提高治療效果，降低放療的毒副反應(yīng)。    1 材料與方法    1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用10%牛血清（PAA Laboratories Gmbh）DMEM（PAA

11、Laboratories Gmbh，Hyclone）培養(yǎng)液在37，5%條件下培養(yǎng)HCT116 細(xì)胞（human colon cancer cells）。    1.2 細(xì)胞毒性分析 取對(duì)數(shù)生長期HCT116細(xì)胞，常規(guī)消化成2×104/ml的單細(xì)胞懸液，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。5%、37 環(huán)境 中培養(yǎng)24h后對(duì)HCT116細(xì)胞分別用：(1）零處理；(2）灰樹花多糖(3g/ml）處理1天；(3）X-射線（4Gy）處理1天；(4）第1天X-射線（4Gy）處理，第2天灰樹花多糖（3g/ml）處理；(5）第1天、第2天都用X   &#

12、160;       -射線（4Gy）處理細(xì)胞。X-射線的處理是采用西門子直線加速器12MeV電子線照射。次日每孔細(xì)胞中加入20l的CCK-8試劑（Dojindo Laboratories），5%、37 環(huán)境 中培養(yǎng)2h后，在酶標(biāo)儀（BIO-TEK）上波長450nm處讀取光密度A值，計(jì)算細(xì)胞存活率（cell survival rate，CSR）。    細(xì)胞存活率（CSR）=試驗(yàn)組A值對(duì)照組A值×100%    1.3 凋亡檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長期HCT116細(xì)

13、胞，常規(guī)消化成2×104/ml的單細(xì)胞懸液，接種于 3.5cm培養(yǎng)皿。5%、37環(huán)境中培養(yǎng)24h后對(duì)HCT116細(xì)胞采用第1天X-射線（4Gy），第2天灰樹花多糖（3g/ml）的方法處理，對(duì)照組零處理。處理48h后，PBS洗滌細(xì)胞，用DNA結(jié)合染料Hoechst 33258 （0.5g/ml ）染色，顯微鏡下觀察和計(jì)數(shù)。隨后上述48h處理細(xì)胞采用Apoptosis Ladder Detection Kit （Wako，Osaka，Japan）抽提DNA，2%的瓊脂糖磷膠電泳后用SYBR Green I （Molecular Probes，Eugene，OR）染色檢測(cè)。 &#

14、160;  1.4 RNA抽提和RT-PCR RNeasy kit (Qiagen)提取處理過的HCT116細(xì)胞總RNA并合成相應(yīng)的cDNA，對(duì)Bax基因作RT-PCR，PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖電泳觀察結(jié)果。引物序列：Bax正5- GTCGCCCTTTTCTACTTTGC-3，Bax反 5- GGAGGAAGTCCAATGTCCAG-3； GAPDH正5-GGTCGTATTGGGCGCCTGGTCACC-3，GAPDH反，5-CACACCCATGACGAACATGGGGGC-3。    1.5 統(tǒng)計(jì) 學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)表示，采用t檢

15、驗(yàn)。    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果    2.1 灰樹花多糖聯(lián)合X-射線對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用 近年來對(duì)X射線所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及特點(diǎn)研究較多，表明高能X射線可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，凋亡的出現(xiàn)與放射劑量、時(shí)間及細(xì)胞固有的放射敏感性都呈一定的相關(guān)性。但高能X-射線處理在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡上的作用并不顯著5。為了檢測(cè)灰樹花、X-射線以及二者使用的協(xié)同作用，我們對(duì)人的腸腫瘤細(xì)胞株HCT116分別用：(1）零處理；(2）一天灰樹花多糖（3g/ml）處理；(3）一天X-射線（4Gy）處理；(4）第1天X-射線（4Gy），第2天灰樹花多糖（3g/

16、ml）處理；(5）兩天都用X-射線（4Gy）處理。48h后用CCK-8試劑盒測(cè)得腫瘤細(xì)胞HCT116的生存率，結(jié)果如圖1所示。我們可以觀察到與單用灰樹花多糖（細(xì)胞存活率為80%）或單用X-射線（細(xì)胞存活率為37%）相比，第1天用X-射線輻射處理、第2天用灰樹花多糖處理對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用更強(qiáng)大，細(xì)胞存活率降為16.7%，接近兩天均采用X-射線輻射的效果（細(xì)胞存活率為13.1%）。圖1 用灰樹花與X-射線協(xié)同抗腫瘤作用 第1天，第2天分別用灰樹花（3g/ml）和X-射線(4Gy)處理HCT116細(xì)胞，細(xì)胞存活率結(jié)果用Cell Counting Kit-8檢測(cè)獲得眾所周知，放射治療雖然對(duì)腫瘤細(xì)胞的

17、殺傷力強(qiáng)，但其毒副作用也十分明顯。病人長期放療會(huì)嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量，也阻礙了治療的深入進(jìn)行?；覙浠ǘ嗵鞘菑乃幨硟捎谜婢覙浠ㄖ刑崛〉玫降恼婢嗵?，本身是一種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，對(duì)機(jī)體沒有副作用。本研究發(fā)現(xiàn)：第1天用X-射線輻射處理、第2天改用灰樹花多糖處理，不但沒有減弱其直接對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力，而且還能在 臨床 應(yīng)用 時(shí)激活病人的免疫機(jī)能，大大提高病人的生活質(zhì)量。    2.2 灰樹花多糖聯(lián)合X-射線誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡 為了檢測(cè)灰樹花多糖聯(lián)合X-射線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，熒光顯微鏡下觀察Hoechst33258染色后的細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：第1天X-射線、第2

18、天灰樹花多糖聯(lián)合處理后，大量HCT116細(xì)胞核破裂呈分葉狀小核，為凋亡細(xì)胞的典型形態(tài)；而對(duì)照組核呈光滑完整的圓形，為正常細(xì)胞。我們將聯(lián)合處理后的細(xì)胞用Apoptosis Ladder Detection Kit抽提DNA，電泳時(shí)出現(xiàn)了凋亡細(xì)胞較為典型的DNA梯形條帶，如圖2所示，說明灰樹花多糖聯(lián)合X-射線處理可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。    2.2 灰樹花多糖聯(lián)合X-射線誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡 為了檢測(cè)灰樹花多糖聯(lián)合X-射線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，熒光顯微鏡下觀察Hoechst33258染色后的細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：第1天X-射線、第2天灰樹花多糖聯(lián)合處理后，大量HC

19、T116細(xì)胞核破裂呈分葉狀小核，為凋亡細(xì)胞的典型形態(tài)；而對(duì)照組核呈光滑完整的圓形，為正常細(xì)胞。我們將聯(lián)合處理后的細(xì)胞用Apoptosis Ladder Detection Kit抽提DNA，電泳時(shí)出現(xiàn)了凋亡細(xì)胞較為典型的DNA梯形條帶，如圖2所示，說明灰樹花多糖聯(lián)合X-射線處理可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。    圖2 灰樹花和X-射線聯(lián)合處理誘發(fā)HCT116細(xì)胞凋亡    2.3 灰樹花多糖協(xié)同X-射線誘導(dǎo)Bax基因的表達(dá) 本實(shí)驗(yàn)中，人腸癌細(xì)胞系HCT116的抑癌基因p53表達(dá)為野生型。p53是一種非常重要的抑癌基因，它

20、的功能主要表現(xiàn)為控制細(xì)胞的生長和促進(jìn)細(xì)胞凋亡6，7，所以p53蛋白質(zhì)又被稱為“警戒蛋白”，在正常細(xì)胞中p53基因表達(dá)的量是十分低下的，但是有些腫瘤細(xì)胞中p53的表達(dá)卻異常高，HCT116細(xì)胞株就是1例。Bax是p53誘導(dǎo)后表達(dá)的下游基因，可促使細(xì)胞凋亡。通常認(rèn)為，p53表達(dá)異常高的腫瘤細(xì)胞中Bax的表達(dá)量卻很低，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的凋亡。本研究為了探討灰樹花多糖聯(lián)合放療抗腫瘤細(xì)胞作用的分子機(jī)理，我們用PCR方法，半定量                  

21、）和X-射線處理HCT116細(xì)胞后，抽提RNA用RT-PCR分析Bax基因的表達(dá)，GAPDH作為對(duì)照其他的研究也指出，單用X-射線的處理使p53與Bax基因啟動(dòng)子的結(jié)合能力增強(qiáng)的作用并不明顯5。這樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果讓我們有理由相信：在HCT116細(xì)胞中，第1天X-射線、第2天灰樹花多糖聯(lián)合處理，在抗腫瘤中的協(xié)同作用是通過增強(qiáng)Bax基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。    3 討論    惡性腫瘤依然是當(dāng)前危害人類健康的主要疾病之一。手術(shù)治療、放療和化療是腫瘤治療的三大傳統(tǒng)手段，20世紀(jì)80年代起腫瘤的生物治療開始日益引起人們的重視，并

22、被廣泛 應(yīng)用 于 臨床 且取得了一定的療效，成為腫瘤治療的第四大重要手段。近年來，腫瘤四大治療手段共同配合、綜合應(yīng)用，在腫瘤治療中已取得顯著療效，并為廣大腫瘤臨床 工作 者所接受，成為腫瘤治療的最佳和最流行模式。研究生物治療與其他治療手段的協(xié)同作用及其分子機(jī)理，無疑將有助于生物治療在腫瘤綜合治療中發(fā)揮更重要的作用，達(dá)到延長腫瘤患者生存時(shí)間、改善生活狀態(tài)的治療目的。    放射治療可殺滅腫瘤細(xì)胞，同時(shí)不同腫瘤細(xì)胞在接受放療后，可使細(xì)胞周期出現(xiàn)G1期阻滯、G2期阻滯和S期阻滯的不同變化810。    隨著生物技術(shù)的日新

23、月異和分子生物學(xué)的興起，人們?cè)絹碓街匾晫?duì)食用真菌的研究，藥食兩用真菌灰樹花的抗腫瘤功效日益引人注目?；覙浠ǘ嗵鞘且环N強(qiáng)效生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，可以有效激活細(xì)胞免疫功能，活化人體免疫細(xì)胞群，刺激各種細(xì)胞因子大量分泌，增強(qiáng)腫瘤局部免疫反應(yīng)36?；覙浠ǘ嗵强鼓[瘤活性已得到 醫(yī)學(xué) 界的廣泛認(rèn)可和證實(shí)，但灰樹花多糖與放療協(xié)同抗腫瘤作用以及分子機(jī)理的研究卻少見于報(bào)道。    本研究發(fā)現(xiàn)：灰樹花多糖聯(lián)合放療的協(xié)同抗腫瘤作用十分明顯（圖1），可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡（圖2）。更深入的分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，凋亡相關(guān)基因Bax基因的表達(dá)增加參與了這個(gè)作用。  

24、60; P53是目前世界上被研究得最為透徹的抑癌基因。它在控制細(xì)胞生長，增殖及凋亡方面充當(dāng)著重要作用1114。當(dāng)細(xì)胞由于外界因素使DNA遭受損傷時(shí)，p53基因即被激活，由此而激活其下游的蛋白質(zhì)p21（sip1/waf1/sdi1）的表達(dá)而使細(xì)胞停止生長進(jìn)行修復(fù)，而當(dāng)DNA損傷嚴(yán)重時(shí)p53又能啟動(dòng)其凋亡信號(hào)途徑-Bax基因的表達(dá)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Bax基因是1993年Oltvai首次發(fā)現(xiàn)可作為調(diào)控Bcl-2的一個(gè)相關(guān)蛋白15。與Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡相反，Bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2/Bax的比值對(duì)細(xì)胞接受刺激后存活有關(guān)鍵作用。在正常細(xì)胞中p53的表達(dá)量非常低，而在有些腫瘤細(xì)胞中p53

25、的表達(dá)卻異常的高。通常認(rèn)為p53的表達(dá)異常高的腫瘤細(xì)胞中Bax的表達(dá)量卻很低，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的凋亡。本研究中所采用的人腸癌細(xì)胞系HCT116即是p53的表達(dá)量很高的細(xì)胞系。本研究發(fā)現(xiàn)，灰樹花多糖與放療協(xié)同作用可以大大增強(qiáng)p53下游基因凋亡相關(guān)基因Bax的表達(dá)（圖3）。    多糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和研究手段的有限性，使多糖研究遠(yuǎn)落后于蛋白質(zhì)和核酸。絕大部分活性多糖在人體內(nèi)的作用機(jī)理還是未知的。本研究對(duì)灰樹花多糖協(xié)同放療抗腫瘤作用的研究只是一個(gè)初步的嘗試，但卻得到了令人振奮的結(jié)果?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】    1 Wu G S，Burns T F，McDonald III E R，et al. KILLER/DR5 is a DNA damage-inducible p53-regulated death receptor gene. Nat Genet，1997，17：141-143.    2 Mayell M. Maitake extracts and th Ei