生物化學與分子生物學-生化綜述

1、 生物化學綜述題目： 蛋白質(zhì)泛素化修飾及其應用 院系： 生命科學技術(shù)學院 專業(yè)： 生物化學與分子生物 姓名： 學號： 蛋白質(zhì)泛素化修飾及其應用摘要：泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin-proteasome system, UPS)介導了真核生物80%85%的蛋白質(zhì)降解,該蛋白質(zhì)降解途徑具有依賴 ATP、高效、高度選擇性的特點。除參與蛋白質(zhì)降解之外,泛素化修飾還可以直接影響蛋白質(zhì)的活性和定位。由于泛素化修飾底物蛋白在細胞中的廣泛存在,泛素化修飾可以調(diào)控包括細胞周期、細胞凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA 損傷修復以及免疫應答等在內(nèi)的多種細胞活動。p53、NFB 和 GADD45 是在細胞應激損傷反應中具

2、有廣泛調(diào)控作用的信號蛋白，發(fā)生在這些分子上的泛素化修飾反應是它們發(fā)揮相關分子機制的重要基礎。關鍵詞：泛素化；p53；NFB；GADD45；細胞應激1 蛋白質(zhì)的泛素化修飾反應1.1泛素及泛素化泛素(Ubiquitin)是一種由 76 個氨基酸構(gòu)成、在真核生物中廣泛存在并具有高度保守性的多肽1。一個或多個泛素分子在一系列酶的作用下與底物蛋白質(zhì)分子共價結(jié)合的翻譯后修飾過程稱為泛素化修飾(Ubiquitination/Ubiquitylation)。泛素化修飾最早被發(fā)現(xiàn)的功能是標記靶蛋白,使之被蛋白酶體識別并降解,整個過程涉及泛素分子、底物蛋白、多種酶系統(tǒng)(如泛素激活酶(Ubiquitin-activ

3、ating enzyme,E1)、泛素結(jié)合酶(Ubiquitin-conjugating enzyme, E2)、泛素連接酶(Ubiquitin-protein ligase, E3)、去泛素化酶(Deubiquitinating enzyme, DUB), 以及蛋白酶體,它們共同構(gòu)成了泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin-pro-easome system, UPS)。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)介導了真核生物體內(nèi)80%85%的蛋白質(zhì)降解,該蛋白質(zhì)降解途徑具有依賴ATP、高效、高度選擇性的特點。泛素化修飾是一種重要的翻譯后修飾, 其扮演的角色遠比最初認識的要多得多,還參與調(diào)控諸如轉(zhuǎn)錄因子活性、逆轉(zhuǎn)錄

4、病毒的出芽、受體的內(nèi)吞作用和溶酶體的運輸、胰島素水平和TGF-通路等。研究表明泛素化修飾的作用已不僅僅局限于介導蛋白質(zhì)的降解2,3, 泛素化修飾還可以直接影響蛋白質(zhì)的活性和定位。蛋白質(zhì)修飾及降解貫穿幾乎所有細胞活動,包括基因表達、細胞增殖、分化、衰老、凋亡和自噬,也調(diào)控著個體的生長、發(fā)育和衰老。蛋白質(zhì)的調(diào)控異常往往伴隨著個體的發(fā)育異?；蚣膊〉陌l(fā)生,與各種人類重大疾病的發(fā)生、發(fā)展、診斷和治療密切相關。由于底物蛋白廣泛存在于細胞中,泛素化修飾調(diào)控的細胞活動主要包括細胞周期、細胞凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA 損傷修復及免疫應答等。1.2泛素化修飾條件泛素化修飾反應有3種不同的類型：單泛素化（monou-b

5、iquitination）， 即單個泛素分子結(jié)合到底物蛋白的Lys 殘基，單泛素化的底物還能進一步被多泛素化；多個單泛素（multiplemonoubiquitination），即底物蛋白質(zhì)的多個 Lys 殘基同時被多個單泛素分子標記；多聚泛素化（polyubiquitination），即由數(shù)個泛素分子形成的泛素鏈 C 端的 Gly 與單泛素化底物特異性結(jié)合。蛋白質(zhì)的泛素化修飾反應的重要生物學效應之一是介導靶蛋白進入26S蛋白酶體實現(xiàn)降解反應；另外，泛素化修飾反應最近也被證實是蛋白質(zhì)功能調(diào)控的一種嶄新模式4。無論是哪種效應，泛素化修飾反應在眾多細胞生命過程中都發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用，如細胞凋亡、

6、細胞周期控制、細胞應激反應（如感染、熱激、紫外線刺激、氧化損傷）等。蛋白質(zhì)的泛素化修飾反應首先是由蛋白質(zhì)本身的一級結(jié)構(gòu)特征決定的。蛋白質(zhì)通常需要包含能被泛素系統(tǒng)識別的一級序列才能被修飾。如（ProGluSerThr（PEST）四肽結(jié)構(gòu)域被認為是靶蛋白上決定泛素化修飾反應發(fā)生的重要保守序列。另外，一些包含能被磷酸化的Ser和Thr殘基的氨基酸序列（DpSGIHpS，LPpTPP）也被先后鑒定為決定蛋白質(zhì)進入泛素化修飾途徑的結(jié)構(gòu)基礎，并逐步明確了“泛素化修飾通常與磷酸化反應相偶聯(lián)”的作用模式。除此之外，Varshavsky5的實驗結(jié)果表明，蛋白質(zhì)的泛素化與其N端序列有關，從而提出了N端規(guī)則，即通過

7、蛋白質(zhì)N 端的氨基酸來預測它的半衰期。蛋白質(zhì)決定N端識別的因子，稱為 N降解決定子（Ndegron），但Ndegron 啟動并標記泛素的機制還不清楚。某些情況下能被泛素系統(tǒng)識別的信號可能隱藏在疏水核中或被掩蓋，那么通常這些蛋白就不能實現(xiàn)泛素化修飾。1.3泛素化反應機理泛素化修飾反應由E1的作用起始。泛素分子在E1的作用下活化，E1能夠利用 ATP 提供的能量在泛素C端 Gly殘基上的羧基集團與它自身的 Cys 殘基上的巰基集團間形成高能硫酯鍵。激活的泛素通過轉(zhuǎn)酰基反應再被轉(zhuǎn)移到E2的Cys殘基的巰基上。最終激活的泛素或者通過E2直接連到蛋白底物上，或是與E3共同作用在泛素分子 Gly76的C端

8、和靶蛋白 Lys 殘基的氨基之間形成氨基異肽鍵。泛素被轉(zhuǎn)移到與E2 結(jié)合的E3上，并通過相似的異肽鍵連接到靶蛋白Lys殘基的氨基上，就是單泛素化修飾反應。重復這個過程即可以形成多泛素化修飾反應。需要說明的是，泛素分子上包括7個 Lys 殘基，分別位于6、11、27、29、33、48 和 63 位，目前研究較多的是Lys48和 Lys63參與的泛素化修飾反應。研究表明，與Lys48結(jié)合的多泛素鏈能夠介導泛素化底物進入26S蛋白酶體降解途徑；而與Lys63結(jié)合的多泛素鏈介導的泛素化反應不能誘導底物蛋白的降解，而是對蛋白質(zhì)的功能產(chǎn)生調(diào)控作用，并在DNA損傷修復、炎癥反應和核糖體蛋白的合成中發(fā)揮重要效

9、應。細胞一般表達單一E1、約60種E2和近400種E3，而泛素化修飾反應的特異性主要由靶蛋白與其對應的特定E3發(fā)生結(jié)合的情況而決定。根據(jù)其結(jié)構(gòu)特征，E3酶主要分為HECT家族（homologous toE6AP carboxy terminus）、Ringfinger家族（reallyinteresting new gene）兩大類。HECT家族E3酶的發(fā)現(xiàn)源于對與宮頸癌發(fā)病密切相關的人乳頭瘤病（humanpapillomavirus，HPV）的研究。最初的研究發(fā)現(xiàn)，細胞中表達的E6AP（E6 associated protein）能夠與 HPV 編碼的E6癌蛋白結(jié)合，二者形成的復合物能夠介導

10、 p53 的泛素化修飾反應，并最終導致p53 進入蛋白酶體降解途徑。對 HECT 家族E3酶的研究還表明，有些E3酶能夠作用于多種不同的蛋白質(zhì)底物，說明它們可通過其他輔助因子的作用取得底物特異性。Ringfinger 家族 E3酶的一級結(jié)構(gòu)通常包含由38個Cys和 His 殘基組成的保守序列 CysX2CysX（939）CysX（13）HisX（23）CysX2CysX （448）CysX2Cys，X代表任意一種殘基），這一序列可形成環(huán)指結(jié)構(gòu)6。 含有環(huán)指的蛋白質(zhì)也是許多亞基 E3 酶的重要組成部分。常見的環(huán)指類E3酶有 SCF 復合體、VHLCBC 復合體和 APC復合體等。其中SCF類E3

11、酶是由至少 4種多肽組成的復合體，包括連接蛋白 Skp、Cullin 類蛋白 Cul、底物識別蛋白 Fbox 和含有一個 RINGH2 型結(jié)構(gòu)域的 Rbx1（RING box 1）。目前已發(fā)現(xiàn)超過100種Fbox 蛋白質(zhì)，它們通常含有參與蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用的WD40重復序列或富Leu重復序列。SCF類E3 酶可利用不同的Fbox蛋白質(zhì)識別多種底物，甚至有時一種 Fbox 蛋白質(zhì)能識別多種不同的底物。在細胞應激反應過程中涉及多種分子的泛素化修飾反應及其相關的蛋白質(zhì)功能調(diào)控作用。以下將以 p53、NFB、GADD45 為例，講述蛋白質(zhì)的泛素修飾反應在細胞應激反應過程中的關鍵作用。2 泛素化的應用

12、中的調(diào)控模式和幾種重要因子及發(fā)展2.1 p53 在細胞應激反應中的調(diào)控模式p53是一種在細胞應激損傷條件下（如 DNA 損傷、缺氧、癌基因表達等）對維持基因組穩(wěn)定性具有核心調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子型抑癌蛋白。其功能主要表現(xiàn)為通過誘導或抑制p53下游靶基因表達，介導應激損傷信號刺激作用下的細胞保護效應，如細胞周期行進抑制、DNA 損傷修復、誘導細胞進入衰老或凋亡狀態(tài)等。在靜息狀態(tài)和細胞應激反應過程中，p53的表達水平主要由泛素化系統(tǒng)介導的翻譯后修飾反應所控制。通常在正常細胞中，組成性合成的 p53 能夠被迅速泛素化并進入26S蛋白酶體實現(xiàn)降解反應，所以正常細胞內(nèi)的 p53水平極低。 Mdm2是催化p5

13、3實現(xiàn)泛素化修飾反應的關鍵 E3泛素化連接酶7。Mdm2 能夠誘導 p53 的單泛素化和多泛素化修飾反應。8 當 Mdm2 低水平表達時，它能夠催化 p53 實現(xiàn)單泛素化反應，并使之出核降解或在細胞質(zhì)中進行進一步修飾；當Mdm2高水平表達時，p53 很快在核內(nèi)實現(xiàn)多泛素化修飾反應，并進而被核蛋白酶體降解。在細胞應激損傷反應初期，細胞內(nèi)的p53水平顯著增高，活化的 p53 進一步誘導 Mdm2 表達水平升高；在 DNA 損傷反應后期，高水平的 Mdm2 可催化p53實現(xiàn)泛素化修飾反應并快速降解。這種 p53Mdm2 的反饋作用機制能夠?qū)崿F(xiàn)對 p53 表達水平和功能的精確調(diào)控。雖然 Mdm2在 p

14、53 的泛素化過程中具有非常重要的作用，但越來越多的證據(jù)表明，其他幾種泛素連接酶也能夠參與 p53 的泛素化降解反應。ARFBP、COP1、Pirh2、TOPORS和 NIRF都具有E3酶活性，它們能夠通過 Mdm2 非依賴途徑使p53發(fā)生泛素化而降解，因此在 p53 的功能調(diào)節(jié)中亦發(fā)揮重要作用。2.2 NFB 在細胞應激反應中的多種泛素化修飾作用NFB 是一種分布與作用均十分廣泛的真核細胞轉(zhuǎn)錄因子。 它可被多種外界刺激信號活化，參與細胞增殖、分化、凋亡、炎癥等多種條件下的基因調(diào)控，具有十分重要的生理和病理作用。NFB 在誘導活化和發(fā)揮生物學功能過程中受到了泛素化修飾反應的精確調(diào)控。NFB 家

15、族包括 5 種功能相關的蛋白亞基，分別是 p50（NFB1）、p52（NFB2）、p65（RelA）、cRel（Rel）和 RelB，它們之間可形成同型或異型二聚體。在細胞靜止狀態(tài)時，NFB通過與其抑制子 IB結(jié)合，使 NFB以非活性的形式被阻滯在細胞漿中。NFB的誘導活化可通過經(jīng)典途徑和替代途徑實現(xiàn)。 經(jīng)典途徑中，在某些應激信號如 TNF和IL1刺激下，可通過特定信號通路激活 IB 激酶（IKK）復合物?；罨?IKK 使 IB N 端的 Ser32和Ser36被磷酸化， 隨后啟動 IB的泛素化修飾反應并進入26S蛋白酶體降解。IB降解后使 NFB得以釋放并轉(zhuǎn)位到細胞核內(nèi)，進而調(diào)節(jié) NFB

16、下游靶基因的表達。 IB 的泛素化修飾由E2家族的UBC459和SCFTrCP E3連接酶10執(zhí)行。哺乳動物中的2種TrCP蛋白（TrCP1 和 TrCP2）通過它們C端WD40重復序列連接到磷酸化后的 IB上，使 IBN 末端保守的 Lys21和 Lys22處形成 Lys48連接的多聚泛素化修飾反應。B細胞刺激因子（Bcell activating factor belonging to the TNFfamily，BAFF）等主要以替代途徑激活 NFB。BAFF與其受體 BAFFR結(jié)合后可激活NIK激酶，后者能夠催化 IKK 活化，并使 NFB p100發(fā)生磷酸化和泛素化依賴的誘導性剪切反

17、應，釋放成熟p52亞基，并進一步與RelB形成復合物, 調(diào)控相應的NFB靶基因表達。由此可見，泛素化修飾反應在 NFB兩條通路誘導激活過程中具有關鍵作用。另外，發(fā)生在 NEMO、TRAF 等分子上的多泛素化 修 飾 對NFB 信號通路的活化調(diào)控也至關重要.2.3 GADD45 泛素化調(diào)控的新機制研究GADD45家族是一類能夠在細胞應急損傷反應過程中參與細胞周期調(diào)控、細胞凋亡反應和維持基因組穩(wěn)定性的重要信號分子，同時也是一類在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中具有關鍵調(diào)控作用的腫瘤抑制因子，目前發(fā)現(xiàn)主要包括、 和 等3個成員。近幾年來，有關該家族分子的基因表達調(diào)控和多樣性生物學效應機制研究一直倍受矚目。結(jié)語泛

18、素蛋白酶體途徑是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)應激反應過程中蛋白質(zhì)表達水平與功能的重要機制，在越來越多的細胞生命過程已證實有泛素系統(tǒng)的參與，對維持細胞的穩(wěn)態(tài)有十分重要的意義。該途徑在20 世紀 80 年代初首先被 Hershko、Ciechanover 和 Rose所認識，3 人以此項成果共享 2004 年諾貝爾化學獎。隨著蛋白質(zhì)泛素化調(diào)控機制研究的逐步深入，一些新問題出現(xiàn)，成為該領域的研究熱點和關鍵，例如泛素蛋白酶體途徑如何對蛋白質(zhì)降解信號進行識別以及它們被標記的具體機制，E3酶結(jié)合泛素鏈的方式等。另外，泛素蛋白酶體途徑的功能失常與許多疾病的發(fā)生存在密切聯(lián)系，因此其臨床醫(yī)學意義越發(fā)受到重視。泛素化途徑深層機制的

19、揭示，不僅能夠提供重要的基礎理論創(chuàng)新性研究發(fā)現(xiàn)，同時也將展現(xiàn)出重要的醫(yī)學價值。參考文獻：1Jennissen HP. Ubiquitin and the enigma of intracellular protein degradation. Eur J Biochem, 1995, 231(1): 130.2 Hicke L. Protein regulation by monoubiquitin. Nat Rev Mol Cell Biol, 2001, 2(3): 195201.3 Pickart CM. Ubiquitin enters the new millennium. Mol

20、Cell, 2001, 8(3): 499504.4Pickart C M, Eddins M J, Ubiquitin:structures, functions, mechanismsJBiochim Biophys Acta, 2004,1695(13):55725 Bachmair A, Finley D, Varshavsky AIn vivo half life of aprotein is a function of its aminoterminal residueJScience,1986,234(4773):1791866 Myung J, Kim K B, Crews C MThe ubiquitin proteasome pathway and proteasome inhibitors JMed Res Rev, 2001