組織工程重點

1、組織工程的三要素及其功能1. 支架：誘導立體定向生長、誘導血管生長、供給營養(yǎng)物質(zhì)及生長因子，處理代謝廢物，模擬細胞外基質(zhì)的微環(huán)境。2. 種子細胞：可來源于自體細胞、同種異體細胞、異體細胞、干細胞；可通過單層貼壁生長、懸浮生長、三維立體生長等方式來培養(yǎng)。3. 生長因子：可刺激種子細胞的生長和分化，調(diào)節(jié)種子細胞的活性。組織工程的操作過程 選擇合適的支架材料對支架進行塑形在支架上種植活細胞添加合適的生長因子種子細胞沿支架材料多向生長，形成三維立體組織（在生物反應(yīng)器中）移植到人體內(nèi)重建該組織功能新生組織中血管生成支架材料溶解新生組織最終與人體內(nèi)環(huán)境融合支架材料的選擇標準1 具有生物相溶性及功能2 表面

2、理化性質(zhì)易于細胞的粘附和增殖3 可控的生物降解和生物吸收性質(zhì)4 有很好的機械強度，可承受壓力，例如骨組織支架材料5 三維支架材料具有多孔性，使各個微小的結(jié)構(gòu)可以相互連通6 沒有免疫原性7 不會引起感染8 性質(zhì)穩(wěn)定干細胞是一類幼稚型細胞，具有增殖和分化的潛能以及自我更新的能力，可以分化形成各種成熟的體細胞類型。根據(jù)其分化潛能大小可分為全能干細胞、萬能干細胞、多能干細胞、專能干細胞。干細胞的分類Totipotent:受精卵，可分化形成所有體細胞類型Pluripotent：胚胎干細胞，分化形成三個胚層來源的細胞Mutipotent：骨髓間充質(zhì)干細胞等，分化形成單一胚層來源的細胞Unipotent：各

3、組織內(nèi)干細胞，只能分化形成該組織細胞干細胞來源胚胎來源：胚胎干細胞：ES細胞 胚胎性腺軸細胞：EG細胞 （生殖嵴干） 畸胎瘤細胞：EC細胞胎兒來源：臍帶、胎盤、羊水成體來源：骨髓：造血干細胞、間充質(zhì)干細胞 組織：神經(jīng)、骨骼肌等組織內(nèi)專能干細胞ES細胞來源于5-7天未植入囊胚內(nèi)細胞團，具有自我更新的能力（每一次分裂形成兩個細胞，其中一個繼續(xù)分化，另一個保留下來，仍是ES細胞），是萬能干細胞，可分化形成三個胚層來源的細胞。成體干細胞是一類存在于分化成熟組織中的未分化的細胞，具有自我更新的能力，可分化形成該組織各類型細胞。胚胎干細胞和成體干細胞的對比ES胚胎干細胞成體肝細胞細胞類型Pluripote

4、nt萬能Multipotent多能增殖能力增殖旺盛增殖限制來源不是自體的自體的倫理問題倫理方面的擔憂很少爭議致癌性致癌的不致癌的成體干細胞類型（主要） 骨髓間充質(zhì)干細胞（MSC） 造血干細胞（HSC） 神經(jīng)干細胞（NSC） 肝干細胞MSC提取取骨髓離心取低密度層細胞培養(yǎng)成體干細胞可塑性 成體干細胞是一種多能干細胞，正常情況下只能分化形成改胚層來源的細胞，但成體干細胞仍具有可以分化形成其他胚層分化來源細胞的能力，即跨胚層分化。造血干細胞定位轉(zhuǎn)移 成人：HSC存在于脊髓和淋巴組織中 胎兒：HSC存在于卵黃囊、肝、脾中（髓外造血）造血干細胞HSC 多能干細胞，可通過增殖和分化形成紅細胞、白細胞以及其

5、他血細胞，補充衰老和死亡的血細胞，重建整個造血系統(tǒng)。常常被用于白血病以及其他血液病的治療。含量極低，僅占骨髓細胞的1/50000。具有自我更新的能力，產(chǎn)生新的HSC細胞以及分化形成各血細胞類型。造血干細胞特性及來源 特性：具有很強的自我更新以及增殖和分化的能力 CD34是HSC的表面標記 多能干細胞，可分化形成髓系各祖細胞類型，產(chǎn)生所有的血液細胞 產(chǎn)生特異性的生長因子受體 來源：骨髓、外周血、臍帶血、胚胎干細胞造血干細胞和祖細胞的區(qū)別1. 造血干細胞在一定因素的調(diào)節(jié)之下可以分化為各類血細胞的祖細胞2. 祖細胞也是一種相當原始的具有增殖能力的細胞，但已失去多向分化的能力，只向一個成幾個血細胞方向

6、定向增殖分化。3. 造血干細胞分化形成不同的祖細胞，祖細胞進而分化形成各幼稚型的血液細胞。4. 祖細胞依靠HSC的增殖分化來補充。生物材料發(fā)展過程 組織工程促進生物材料的發(fā)展：A 上個世紀，生物材料被用于生成永久性植入物來替代組織器官，例如假肢。B 本世紀，生物材料主要被用于生產(chǎn)支架，用于組織工程。C 未來生物才來的發(fā)展方向是用于生產(chǎn)組織工程支架，并且可為種子細胞生長提供所需微環(huán)境，以及用于基因治療。支架的作用1. 支架為種子細胞的粘附、遷移、增殖分化以及分泌細胞外基質(zhì)提供框架。2. 種子細胞在支架材料上生長形成完整的組織后，支架材料通過生物降解而被吸收。3. 支架還可作為一種屏障保護新生組織

7、，防止周圍組織向新生組織滲透，從而有利于新生組織的再生。天然材料天然：膠原、纖維、透明質(zhì)酸、瓊脂等合成：PLA、PGA混合材料：天然與合成材料的相混合陶瓷：羥基磷灰石等天然與合成材料的對比優(yōu)點缺點天然A 存在細胞識別，種子細胞與支架材料通過配體和受體間相互識別以利于種子細胞的粘附B 可自然講解A 可引起免疫排斥反應(yīng)B 批次間存在差異，因為材料來源于天然而非人工生產(chǎn)合成A 批次之間差異小，具有統(tǒng)一性B 可根據(jù)需要進行人工塑形A 生物相溶性尚未被認可B 可降解性尚未被認可生物材料形成 膜狀或管狀：神經(jīng)組織、血管 凝膠狀：種子細胞可均勻散布其中，軟骨組織 多孔狀：三維立體支架、骨、軟骨、真皮支架的作

8、用A 干細胞種植在支架上，支架移植入體內(nèi)正確的位置B 支架上攜帶的各種細胞因子刺激種子細胞分裂增殖C 支架為種子細胞的增殖分化提供營養(yǎng)及框架D 當種子細胞不斷分裂增殖形成的結(jié)構(gòu)足以自我支撐時，支架開始生物降解外周神經(jīng)與中樞神經(jīng)再生修復不同的原因 外周神經(jīng)受損后可再生，中樞神經(jīng)再生受抑制。中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境中存在抑制軸突生長的因子。例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的膠質(zhì)細胞可產(chǎn)生各種抑制因子，而髓鞘細胞僅在中樞中存在，也可產(chǎn)生各種抑制因子。所以中樞神經(jīng)系統(tǒng)的再生受到微環(huán)境抑制。Ips細胞：借助基因?qū)爰夹g(shù)將某些特定因子導入動物或人的體細胞，同時選擇性地在培養(yǎng)液中加入特定的小分子物質(zhì)，即可將體細胞重編程為多潛能

9、干細胞此類細胞在克隆形態(tài)、生長特性、表面標志物、基因表達模式、表觀遺傳學特征、擬胚體形成、畸胎瘤形成和嵌合體形成（針對小鼠）等方面與ES細胞非常相似。誘導性多能干細胞（ips）是通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將某些轉(zhuǎn)錄因子導入動物或人體細胞，使體細胞直接重構(gòu)成為胚胎干細胞細胞樣的多潛能細胞。腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs 或 Tumor stem cells ，TSCs）：腫瘤組織中這些致瘤能力強、有自我更新和分化潛能的細胞。腫瘤干細胞來源的假說主要有兩種：第一種認為正常干細胞是腫瘤發(fā)生的源泉，致癌性突變使正常干細胞內(nèi)在的自我更新和無限增殖能力得到加強，從而轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤干細胞。第二種

10、認為分化較為成熟的細胞（如定向分化的祖細胞）收到外界突變劑、誘導劑等的作用而活化了某些干細胞相關(guān)途徑，去分化而獲得干細胞特性，形成腫瘤干細胞。基因工程 將植物或動物的基因用載體導入活細胞內(nèi)，與生物體基因相整合，從而改變生物原有的特性，通過基因工程的方法可以使外源基因替代體內(nèi)有缺陷的基因從而恢復該基因的功能。肌腱組織工程 肌腱和韌帶有束狀致密結(jié)締組織組成，能接到正常的關(guān)節(jié)運動及維持關(guān)節(jié)的穩(wěn)定。種子細胞成熟機體細胞：肌腱細胞：自體，取材創(chuàng)傷大，數(shù)量難以滿足要求 皮膚成纖維細胞：自體，取材廣泛，數(shù)量多，易培養(yǎng)脊髓間充質(zhì)干細胞：自體，免疫原性低，增殖能力強，分化的多能性-不確定 肌腱細胞合成膠原的能力

11、優(yōu)于間充質(zhì)細胞和成纖維細胞，是較好的肌腱組織工程的種子細胞來源細胞因子EGF-1:促進肌腱細胞的分裂增殖和細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生TGF-1、BMP-12：加速肌腱的愈合BMP-2、BMP-12：促進肌腱附著于骨的連接處纖維軟骨區(qū)的新城BMP-2、BMP-12：誘導MSCs生成韌帶樣組織EGF:促進細胞增殖支架材料 必須具有一定的機械強度、孔隙度及吸水率，可降解，適合種子細胞吸附及增加細胞增殖，并對種子細胞的目的的功能不產(chǎn)生負面的影響，具有良好的生物相溶性等特性。 天然材料：I型膠原、糖胺多糖、羊膜、凍干肌腱等 ，缺點：抗原性強 人工合成材料：碳纖維、尼農(nóng)、滌綸、聚羥基乙酸（PGA），聚乳酸（PLA）

12、、聚乳酸聚羥基乙酸共聚物（PLGA）。缺點：滑動性差，易與周圍組織粘連親水性差，細胞粘著力弱。 復合材料：PLGA與膠原的復合，人發(fā)與膠原的復合 人發(fā)角蛋白：HHK組織工程化肌腱的構(gòu)建目的：獲得人工活性肌腱-種子細胞及細胞外基質(zhì)的裝配構(gòu)建要求： 體外：支架材料必需有足夠的空隙來附著種子細胞 體內(nèi)：必須盡可能少地對細胞及周圍組織產(chǎn)生毒性反應(yīng)。 基質(zhì)支架必須允許細胞滯留并可以傳遞有活性的細胞到達修復部位。旋轉(zhuǎn)式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)（RCCS）優(yōu)點：在微重力條件下：低剪切力 大小不同的顆粒共同培養(yǎng) 有助于三維組織的形成 有助于細胞的分化骨組織工程骨組織細胞：骨祖細胞、成骨細胞、骨細胞、破骨細胞軟骨的發(fā)生：間

13、充質(zhì)細胞骨祖細胞成軟骨細胞軟骨細胞基質(zhì)+纖維軟骨組織周圍間充質(zhì)軟骨膜種子細胞成骨細胞是骨組織工程的種子細胞。目前種子細胞的來源主要有骨外膜、骨髓、骨、骨外組織。優(yōu)點缺點骨外膜含有骨原細胞、成纖維細胞、成骨細胞和破骨細胞。骨原細胞保持著分化潛能，可被激活增殖分化為成骨細胞。取骨外膜培養(yǎng)可分離出成骨細胞。具有很強的繁殖和分化為成骨細胞的能力，易存活供區(qū)組織的損傷骨髓成骨能力來自骨髓基質(zhì)細胞中的纖維細胞集落形成單位，它具有多向分化的潛能，可分化為成骨系細胞、成纖維系細胞、脂肪細胞和網(wǎng)狀細胞。在誘導因子作用下，可使其向成骨細胞系分化的數(shù)量大大增加，表明骨髓基質(zhì)具有很強的成骨潛能。取材容易，損傷較小，傳

14、代能力強因基質(zhì)細胞具有多種分化潛能，應(yīng)選擇適當培養(yǎng)條件，保證其向成骨細胞分化。骨胚胎與新生動物骨及人胚胎骨經(jīng)培養(yǎng)得到成纖維細胞樣細胞，適當條件可進一步分化為成骨細胞易定向分化為成骨細胞供區(qū)損傷及來源的局限性骨外組織起源于胚胎時期間充質(zhì)的骨外部位的骨祖細胞，在誘導因子的持續(xù)作用下可維持其成骨的功能。如周皮細胞、C212成肌細胞、成纖維細胞等。家兔皮膚的成纖維細胞在體外培養(yǎng)，不僅能產(chǎn)生粘多糖和膠原等基質(zhì)成分，還有鈣鹽沉積，有新生骨組織形成，證明皮膚成纖維細胞在體外有成骨的潛能取材容易、創(chuàng)傷小，傳代繁殖快適應(yīng)受區(qū)環(huán)境的能力較差支架材料1. 良好的生物相溶性、生物可降解性2. 良好的骨誘導性和骨傳導性

15、3. 具有負荷最大量細胞的高滲透性4. 支持骨細胞生長和功能分化的表面化學性質(zhì)與微結(jié)構(gòu)5. 可與其它活性分子如骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）、轉(zhuǎn)移生長因子-（TGF-）負荷共同誘導骨發(fā)生6. 易消毒性人工合成聚合物 -聚乳酸（PLA）和聚羥基乙酸（PGA）-聚乳酸與聚羥基乙酸共聚物（PLGA）-多聚羥基酸、聚酣、聚亞胺、聚偶磷氮、膠原-具生物活性的玻璃陶瓷（BGC）、羥基磷灰石（HA）、鈣磷陶瓷即羥基磷灰石和磷酸三鈣（HA/TCP）珊瑚天然無機骨：除去其有機成分，保留無機成分生物性和非生物性材料符合：適合的支架材料與BMP、GF的復合生長因子成纖維細胞生長因子（FGF）轉(zhuǎn)化生長因子-(TGF-)胰島

16、素樣生長因子(IGF)血小板衍化生長因子(PDGF)骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)構(gòu)建方式：支架材料+成骨細胞 支架材料+生長因子 支架材料+成骨細胞+生長因子神經(jīng)組織工程神經(jīng)組織由神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞構(gòu)成。構(gòu)成腦、脊髓和神經(jīng)節(jié)。神經(jīng)細胞本體受傷或近本體的突起受傷，神經(jīng)元會死亡。遠離神經(jīng)元的突起受傷，包體腫脹，尼氏體破碎，傷口處髓鞘和軸索破碎，由巨噬細胞吞噬，只有神經(jīng)膜細胞繁殖，形成實心的細胞索，在斷裂處連接起來，引導新生軸索往遠端生長。若遠端徹底消失，神經(jīng)元就不能恢復原來功能。若受傷的混合神經(jīng)纖維，再生的神經(jīng)纖維長到另一個神經(jīng)纖維的神經(jīng)膜中，仍不能回復功能。種子細胞雪旺細胞（Schwann ce

17、ll）經(jīng)培養(yǎng)和純化后的雪旺細胞在支架內(nèi)有序分布，并且分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，支持引導軸突的再生，是提供啊修復神經(jīng)缺損效果的關(guān)鍵。構(gòu)筑組織工程化人工神經(jīng)，首先需要大量雪旺細胞。但在培養(yǎng)條件下，雪旺細胞生長緩慢，而且容易為成纖維細胞污染。應(yīng)用神經(jīng)體內(nèi)變形發(fā)，可獲得大量純度較高的激活態(tài)雪旺細胞。支架材料聚羥基乙酸（PGA）乙丙交酯(Polyglactin)聚乳酸(PLA)殼聚糖(Chitosan)優(yōu)點：具有良好的生物相溶性，不引起明顯的炎癥反應(yīng)，再生有髓神經(jīng)纖維能沿生物纖維縱向生長。在神經(jīng)導管內(nèi)植入生物纖維網(wǎng)架或?qū)⑸窠?jīng)導管制成具有類似神經(jīng)束狀結(jié)構(gòu)，可引導、促進神經(jīng)軸突的再生。生長因子：用生物降解高分子

18、對神經(jīng)營養(yǎng)因子進行基體包埋或制成微包囊，然后與科生物降解的神經(jīng)導管進行復合，從而可使神經(jīng)營養(yǎng)因子控制性地釋放到神經(jīng)導管內(nèi)，醋精神經(jīng)軸突生長。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）和睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子（CNTF）神經(jīng)生長因子（NGF）人工神經(jīng)的構(gòu)建-血管化神經(jīng)導管內(nèi)的血管的長入，可為種植的雪旺細胞和再生神經(jīng)提供充足的營養(yǎng)，從而加快神經(jīng)再生，延長神經(jīng)的再生距離。管內(nèi)植入血管或加入血管內(nèi)皮細胞生長因子，可望促進神經(jīng)導管的血管化。人工神經(jīng)的構(gòu)建-生物反應(yīng)器的應(yīng)用利用轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器所產(chǎn)生的模擬微重力，使細胞在旋轉(zhuǎn)過程中均勻地分布于在經(jīng)過Laminin涂層的PGA材料的表面。實驗表明，應(yīng)用低密度（103/ml）的

19、雪旺細胞，即能使旺細胞均勻貼附在生物支架表面。脊髓損傷不但取決于即刻的機械損傷，還取決于損傷后形成的細胞微環(huán)境。繼發(fā)的缺血、缺氧、炎癥細胞浸潤，自由基生成，內(nèi)在的可以克服抑制因子的成熟神經(jīng)元大量丟失，體內(nèi)的髓鞘相關(guān)抑制因子可抑制與功能恢復密切相關(guān)的軸突的再生，膠質(zhì)細胞增生形成的瘢痕均在脊髓的繼發(fā)損傷中起著重要的作用。種子細胞Neural Stem Cells , NSCsOlfactory ensheathing cells , OECsSchwan cell , SC生物材料：大體分為五類1. 天然聚合物：藻酸鹽水凝膠、I型膠原2. 合成生物可降解材料如：聚乳酸、聚乙烯乙二醇3. 合成生物非

20、降解聚合物如：聚甲基丙稀酸羥乙酯4. 可降解材料復合物如：聚-聚羥基丁酸鹽（PBH）與藻酸鹽水凝膠復合物5. 非降解材料復合物導管如：丙烯酸聚合物或聚丙烯腈/聚氯乙烯（PNA/PVC）的共聚物攜帶因子或者轉(zhuǎn)基因細胞：釋放神經(jīng)生長因子，神經(jīng)再生抑制因子拮抗劑等兩種類型的材料設(shè)計：定向孔-引導神經(jīng)纖維再生，可注射性，防粘連生長因子神經(jīng)營養(yǎng)因子：NT、BDNF、EGF生長因子被整合到支架材料商后，通過材料講解或者濃度差異以一定的速率釋放出來，其結(jié)果可以改善受損神經(jīng)周圍微環(huán)境和促進細胞的生長，還可以促進神經(jīng)干細胞定向分化成為神經(jīng)細胞。腦組織工程修復材料：明膠和透明質(zhì)酸微球 （透明質(zhì)酸基水凝膠框架材料）

21、待解決的問題 細胞再材料中的高密度復合 材料可注射性，減少手術(shù)導致的二次損傷角膜組織工程組織結(jié)構(gòu)上皮層：5-6層上皮細胞，可再生前彈力層：均質(zhì)透明膜，不可再生實質(zhì)層：由約200層膠原纖維薄板組成，不可再生后彈力層：賤人的透明均質(zhì)膜，可再生內(nèi)皮細胞層：為一層六角形扁平細胞構(gòu)成，不可再生生理特性屈光度：占眼球屈光力的70%透明性：無角化層，無血管，無色素，始終保持半脫水狀態(tài)無血管：營養(yǎng)來自角膜緣血管網(wǎng)，房水及淚腺感覺神經(jīng)豐富：來自三叉神經(jīng)眼之。保護作用種子細胞 可來源于眼的正常角膜，以胎兒眼角膜為佳，供體年齡越小，細胞分裂增殖越快 角膜上皮細胞培養(yǎng)常用植塊培養(yǎng)法和分離細胞培養(yǎng)法 角膜基質(zhì)細胞可從角

22、膜實質(zhì)層獲得 角膜內(nèi)皮細胞培養(yǎng)：眼角膜緣環(huán)形剪下角膜，將角膜內(nèi)皮和后彈力層撕下，分離細胞培養(yǎng)法來源：角膜緣干細胞 胚胎干細胞誘導分化 成體干細胞誘導分化、（皮膚干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞、口腔粘膜上皮細胞）細胞因子 堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）：可促進角膜細胞增殖角膜細胞生長因子（KGF）:可藉此角膜細胞產(chǎn)生多型膠原轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-1）:可使角膜細胞增殖和遷移，促進蛋白合成表皮生長因子(EGF):促進細胞增殖支架材料良好的生物相溶性，自身及其降解產(chǎn)物對機體無毒性，不引起排斥反應(yīng)和炎性反應(yīng)，不致畸變。材料攜帶具有生物誘導性的多種角膜細胞生長因子，可誘導自體多種角膜細胞沿材料支架生長繁殖。支架材料的降解速率與植入角膜細胞形成組織器官的速率想匹配，在支架完成為角膜組織提供模板功能后，可被完全降解吸收，或成為與新生組織相互融合的組成部分?？砂唇悄そM織的特點和缺損情況進行塑形，形成一