用跨越斷裂點的PCR技術(shù)快速診斷一種HPFH缺失突變

1、    用跨越斷裂點的PCR技術(shù)快速診斷 一種HPFH缺失突變        【摘要】目的建立一種簡便快速檢測缺失型遺傳性持續(xù)性胎兒血紅蛋白綜合征(hereditary persistence of fetal hemoglobin，HPFH)的PCR基因診斷技術(shù)。方法基于本室通過序列測定獲得的該基因斷裂點周圍新的DNA順序資料，采用跨越斷裂點的三引物雙重PCR設(shè)計方案，1個共用引物與2個分別針對正常和突變基因的引物在單管反應(yīng)中構(gòu)成2對特異性的PCR反應(yīng)。結(jié)果2個特

2、異性擴增片段分別為565bp和376bp，與預(yù)期的PCR產(chǎn)物大小相符，其中565bp為正常等位基因的擴增產(chǎn)物；376bp產(chǎn)物示缺失型等位基因。此三引物雙重PCR可在同一反應(yīng)體系中進行，其結(jié)果能區(qū)別樣品的不同基因型。結(jié)論該法簡便快速，可作為常規(guī)方法用于臨床疑診樣品的分子篩查?！娟P(guān)鍵詞】遺傳性持續(xù)性胎兒血紅蛋白綜合征聚合酶鏈反應(yīng)-珠蛋白基因 Rapid Detection of an HPFH Deletion by PCR Amplificationwith Three Primers Bridging the BreakpointLIU Zhongying, ZHONG Xionglin, L

3、I Zhiqin, XU Xiangmin*.* Institute of Molecular Biology, First Military Medical University, Guangzhou,【Abstract】ObjectiveTo establish a rapid and reliable PCR method for detecting a deletional hereditary persistence of fetal hemoglobin (HPFH) found in Chinese. MethodsBased on some novel DNA sequence

4、s across the 3breakpoint of a HPFH deletion observed in our laboratory, we designed a PCR amplification with three primers bridging the breakpoint. In this system, oligonucleotide primers have been chosen which allow specific identification of both normal and deletional chromosomes under identical c

5、ondition in either the same or parallel PCR reactions. ResultsThe expected two specific amplification bands were produced; one was 565bp in length and stood for the normal alleles, the other, 376bp in length represented the mutant alleles of -globin gene cluster. This duplex system could directly ge

6、notype DNA samples bearing this type of HPFH deletion. ConclusionThis rapid and inexpensive method could be used as a routine method in the molecular screening of carriers and for the prenatal diagnsis of this disease.【Key words】Hereditary persistence of fetal hemoglobinPolymerase chain reaction-glo

7、bin gene遺傳性持續(xù)性胎兒血紅蛋白綜合征(hereditary persistence of fetal hemoglobin, HPFH)和-地中海貧血(-地貧)是一組遺傳異質(zhì)性很大的血紅蛋白病1，-珠蛋白基因簇的大段缺失是導(dǎo)致該病的重要基因類型，該類型基因還是組成臨床較常見的中間型地貧的主要病理缺陷之一。目前，在中國人中至少發(fā)現(xiàn)了4種此類缺失型基因2，本文涉及的缺失型HPFH曾先后在澳大利亞和美國的越南和柬埔寨裔患者及我國浙江籍病例中發(fā)現(xiàn)3,4。雖然該基因的缺失范圍已經(jīng)確定，但其基因斷裂點尚未完全闡明。我們最近在廣東籍2例HPFH疑診患者中克隆到這一基因，并測定了該基因3端斷裂點周圍

8、的DNA順序，基于該新的DNA順序，我們設(shè)計了PCR引物。此法的建立可為臨床中間型地貧及其它一些血紅蛋白病的鑒別診斷提供一種簡便快速的分子診斷方法和有價值的策略。1材料與方法1.1DNA樣品2份HPFH病例DNA為經(jīng)基因分析確診的缺失型HPFH雜合子樣品，其缺失類型見文獻3,4；正常樣品為本室保存的正常人白細胞DNA。DNA樣品按氯仿酚抽提法或DNA快速抽提法5從人白細胞中提取。1.2引物設(shè)計3個引物的堿基順序依據(jù)我們最近測定的上述缺失型HPFH基因3端斷裂點周圍的新DNA序列結(jié)果和GenBank HUMHBB，分別為：5ATTGTTGAGTTGCAGGATCG3(HPFH-W)，5TGGTA

9、TCTGCAGCAGTTGCC3(HPFH-M)和5AGCCTCATGGTAGCAGAATC3(HPFH-C)。引物的合成采用亞磷酸三酯法(上海賽爾生物技術(shù)公司)。HPFH-W位于3端斷裂點附近的上游，HPFH-M位于該缺失基因5端斷裂點附近的上游，共用引物HPFH-C位于3端斷裂點附近的下游。這樣，在正常等位基因上，HPFH-W與HPFH-C形成一對PCR引物，其擴增產(chǎn)物為565bp，而在缺失等位基因上，由于HPFH-W無結(jié)合位點而致反應(yīng)陰性；相反，HPFH-M與HPFH-C雖然在正常等位基因上都有結(jié)合位點，但因二者相距太遠(5和3端斷裂點之間的DNA片段為30kb)使無法形成PCR反應(yīng)，而

10、在缺失等位基因，此對引物因該基因片段缺失而靠近，其擴增產(chǎn)物為376bp。1.3PCR條件Taq酶和PCR反應(yīng)Buffer購自復(fù)日公司(復(fù)旦大學(xué))，dNTP為德國Boehringer Mannheim產(chǎn)品；50l反應(yīng)總體積中含：0.2g基因組DNA，每種dNTP 100mol/L，和Taq酶2U。分管反應(yīng)時每種引物為0.3mol/L，進行雙重PCR時，HPFH-W和HPFH-M均為0.3mol/L，HPFH-C為0.6mol/L，其它條件相同。PCR在PE-480(美國Perkin-Elmer公司)擴增儀上進行，循環(huán)參數(shù)為：945分鐘，574分鐘(期間加入Taq聚合酶)，723分鐘；以下進行30

11、個循環(huán)：9450秒，571分鐘，721分鐘10秒，最后一個循環(huán)728分鐘。取出后4存放待檢測。PCR產(chǎn)物用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。紫外燈下觀察結(jié)果，拍照留底。2結(jié)果和討論2.1我們設(shè)計的檢測體系，在進行已知樣品分析時，獲得了預(yù)期的檢測結(jié)果。HPFH-WHPFH-C和HPFH-MHPFH-C 2對引物分管反應(yīng)的PCR擴增結(jié)果見1A。擴增產(chǎn)物的大小與經(jīng)序列測定的結(jié)果一致。在此基礎(chǔ)上，我們摸索出了在同一試管中進行雙重PCR的條件，三引物雙重PCR檢測樣品的結(jié)果見1B。2個特異性擴增片段分別為565bp和376bp，其中565bp為正常等位基因的擴增產(chǎn)物；376bp產(chǎn)物示缺失型等位基因。1PCR檢

12、測HPFH缺失突變A：分管反應(yīng)的結(jié)果，B：三引物雙重PCR的檢測結(jié)果Fig 1Detection of an HPFH deletion by PCRTwo PCR amplifications with threeprimers were run in two separate tubes (panel A) or in one tube under same condition(panel B). Panel A:amplified with primers HPFH-W/HPFH-C(lanes 1,3,5 and 7) orwith primers HPFH-M/HPFH-C(lane

13、s 2,4,6 and 8). M:pBR322/Hae DNAmarkers (SABC).Lanes 1, 2:negative control (no DNA); lanes 3,4: DNA from normalindividual; lanes 5,6 and 7,8:two patients' heterozygous DNAs bearing HPFH deletion;Panel B:amplified with three primers(HPFH-W, HPFH-M and HPFH-C)in duplexPCR system. Lane 1:negative c

14、ontrol (no DNA);lane2: DNA from normal individual;lanes 3,4: DNA of two same patients as in Panel A2.2目前臨床診斷HPFH和-地貧主要依賴血液學(xué)分析1，通常需綜合多項RBC和Hb指標(biāo)才能作出診斷，且常難確診。而采用基因診斷技術(shù)則可快速準(zhǔn)確的得出結(jié)果。這一技術(shù)已用于檢測-地貧和一些其它HPFH和-地貧基因6-8，目前的方法多采用2對引物分別反應(yīng)的方式進行，我們采用單管雙重PCR，不僅可節(jié)約試劑和簡化操作，更重要的是增加了方法的可靠性。此三引物雙重PCR可在同一反應(yīng)體系中進行，其結(jié)果可直接檢測出樣

15、品的不同基因型。2.3我們的檢測對象是目前已闡明分子基礎(chǔ)的唯一一種中國人缺失型HPFH(其余為-地貧)，但從現(xiàn)有文獻分析，這一缺失類型應(yīng)屬東南亞和中國南方較常見的HPFH基因2-4，因此，將本法用于該病臨床樣品的分子篩查是有必要的。此外，HPFH與-地貧復(fù)合可產(chǎn)生嚴(yán)重的貧血癥，臨床上一些中間型地貧病例在進行-地貧基因分析后仍難完全診斷，這是地貧基因診斷中值得注意的問題，采用本法進一步分析這類樣品有助于獲得最終診斷，同時也為-地貧復(fù)合HPFH家系病例的產(chǎn)前診斷提供了新方法。本法僅限于一種HPFH的檢測，在闡明中國人該類疾病的分子病理的基礎(chǔ)上，以相同策略設(shè)計針對不同缺失型的引物，結(jié)合多重PCR技術(shù)

16、，是挖掘本法發(fā)展?jié)摿Φ闹匾獌?nèi)容之一。本課題受國家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號39670333)資助*課題負責(zé)人和聯(lián)系人作者單位：劉忠英鐘雄林李志琴徐湘民（510515 廣州，第一軍醫(yī)大學(xué)分子生物學(xué)研究所；）參考文獻1McDonagh KT,Nienhuis AW. The Thalassemias. In: Nathan DG Oski FA. eds. Hematology of infancy and childhood. 4th ed. Mexico:Saunders WB. Company, 1993. 783-879.2徐湘民.見于中國人的HPFH和-地中海貧血的分子基礎(chǔ).中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志

17、，1998，15(5)315-317.3Motum PI, Hamilton TJ, Lindeman R, et al. Molecular characterisation of Vietnamese HPFH. Hum Mutat, 1993, 2(3)179-184.4Dimovski AJ, Divoky V, Adkile AD, et al. A novel deletion of approximately 27kb including the -globin gene and the locus control region 3HS-1 regulatory sequence

18、: 0-thalassemia or hereditary persistence of fetal hemoglobin? Blood, 1994, 83(3)822-827.5Lahiri DK, Schnabel B. DNA isolation by a rapid method from human blood samples: Effects of MgCl2, EDTA, storage time, and temperature on DNA yield and quality. Biochem Genet, 1993,31(7-8)321-328.6Ko TM, Tseng LH, Hsieh FJ, et al. Rapid detection of ChineseG+(A)0-thalassemia by polymerase chain reaction. Acta Haematol, 1993,89(2)80-81.7Bowden DK, Vickers MA, Higgs DR. A PCR-based strategy to dete